固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时测定尿液中9种多环芳烃代谢物
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摘 要 建立了固相萃取-液相色谱-串联质谱同时测定尿中2-羟基萘、1-羟基萘、2-羟基芴、3-羟基菲、1-羟基芘等9种多环芳烃代谢物的液相色谱-串联质谱测定方法。尿样中结合态的多环芳烃代谢物在β-葡萄糖苷酸酶-芳基硫酸酯酶缓冲液（pH 5.0）作用下，于37 ℃水浴中避光水解4 h后，以C18固相萃取小柱富集、净化，以甲醇洗脱，采用Waters Symmetry C18色谱柱，流动相为乙腈-0.2%氨水（72∶27, V/V）等度淋洗分离后进入质谱测定。在喷雾电压4 kV，毛细管温度300 ℃下，以3-羟基菲13C为内标，采用SRM模式负离子扫描方式测定，内标法定量。9种多环芳烃代谢物在尿中的线性范围为0.90～100
SymbolmA@ g/L；相关系数为0.9970～0.9990；回收率为79.0%～119.8%；相对标准偏差为4.3%～12.4%；检出限为0.04～0.90
SymbolmA@ g/L；结果表明，本方法可用于尿中9种多环芳烃代谢物的测定。
关键词 液相色谱-串联质谱； 尿； 多环芳烃代谢物
2011-04-25收稿；2011-06-14接受
本文系国家“十一五”科技支撑基金（No.省略
1 引 言
多环芳烃（PAHs）是最早被人类发现的一类环境致癌化合物，主要来源于煤炭、石油、木材等有机物的热解和不完全燃烧。PAHs数量多、分布广, 与人类健康关系密切，是相当重要的致癌类化合物［1］。PAHs对人体健康的影响一直是研究热点。检测内暴露水平对预测和评估人群接触PAHs具有重要意义。PAHs经人体代谢后转化成葡萄糖苷酸或硫酸盐化合物，从尿液排出。因此通过测定尿液中PAHs代谢物，可以综合反映人体对PAHs的暴露情况。目前，研究最多的PAHs代谢物是芘的代谢物1-羟基芘（1-OHP）。但最近发现，1-OHP与尿中的其它OH-PAHs的相关性不强，因此仅采用1-OHP作为生物标志物并不能真实地反映人体的PAHs暴露水平。为了全面反映各类人群的PAHs的内暴露水平和减小或消除个体差异带来的影响，须使用多个OH-PAHs作为共同生物标志物反映PAHs的内暴露水平。目前检测OH-PAHs的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[2,3]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[4～6]、液相色谱-质谱法（LC-MS）[7～11]。与液相色谱-质谱法（LC-MS）方法比较，高效液相色谱法（HPLC）检出限过高，不适用于非暴露人群的检测；而气相色谱-质谱法（GC-MS）虽然检出限低，灵敏度高，但需要衍生化处理，而且，其前处理净化过程需要多柱联用，处理过程繁琐、耗时；液相色谱-质谱法（LC-MS）具有灵敏度高，检出限低的特点，在OH-PAHs的检测中具有优势。目前，利用固相萃取（SPE）-LC-MS测定的OH-PAHs的方法已多有报道。Ferrari等[7]测定了1-OHP；Wiele等[8]同时测定1-OHN，1-OHP， 7-OHBap等8种OH-PAHs；Xu等[10]同时测定了萘、芴、菲、芘等13种OH-PAHs；朱鹏飞等[11]同时测定了4种OH-PAHs。本研究以13C同位素为内标，利用SPE-LC-MS/MS同时测定人尿样中的多种OH-PAHs,包括2-羟基萘、1-羟基萘、2-羟基芴、3-羟基菲、3-羟基屈、6-羟基屈、1-羟基苯并[a]蒽、1-羟基芘和9-羟基苯并[a]芘。与Xu等[9]的方法比较，本方法缩短了水解时间、减少了浓缩步骤、将流动相梯度淋洗改为等度淋洗，从而减少了有机溶剂的使用量，缩短了样品的前处理和测定时间，提高了部分化合物的检出限。与Wiele等[5]的方法比较，由于检测样品的基质不同，样品的检出限和回收率等暂时无法比较，但将流动相梯度淋洗改为等度淋洗，缩短了样品的测定时间。2 实验部分
2.1 仪器与试剂
LTQ-XL液相色谱-质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific） ：配电喷雾离子化源（ESI源）；漩涡振荡器（中国IKA-MS2）；24孔固相萃取装置（美国SupelcosilTM）； Envi-18固相萃取柱（3 mL，500 mg，美国Supelco公司）；超纯水机（Barnstead超纯水机）。甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck公司）；乙酸钠、乙酸为分析纯（北京化学试剂公司）；实验用水为经Barnstead超纯水机过滤的去离子水；氮气、氦气（＞99.999%）。1-羟基芘、2-羟基芴、β-葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶购于Sigma-Aldrich公司，1-羟基萘、2-羟基萘购于Dr. Ehrenstorfer GmbH， 3-羟基屈、1-羟基苯并（a）蒽、9-羟基苯并[a]芘购于Midwest Research Institute公司；6-羟基屈购于Accustandard公司，3-羟基菲、3-羟基菲13C同位素内标（＞99.5%）购自Cambridge Isotope Laboratories公司。
OH-PAHs的标准溶液：准确称取适量的OH-PAHs化合物的标准品，以甲醇为溶剂，配成不同浓度的标准储备液，然后按表1配制混合标准中间液和混合标准使用液。
醋酸-醋酸铵缓冲溶液：准确称取740.0 g无水醋酸铵，溶解在500 mL水中，即配成醋酸铵饱和溶液，加入冰醋酸（冰醋酸与饱和醋酸铵的体积比约为1∶1），用冰醋酸调至pH＝5.0，即配成所需醋酸-醋酸铵缓冲溶液。
水解酶溶液（现用现配）：依据当天处理样品的数量，按照每个样品使用3000 U β-葡萄糖苷酸酶，70 U芳基硫酸酯酶的量，根据所购β-葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶的含量，计算本次处理样品所需水解酶的量（通常多计算出一份样品的量）后，准确称量β-葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶的量，用醋酸-醋酸铵缓冲溶液定容至样品数×10 mL。
2.2 样品前处理
将冷冻人尿样品放置常温，用0.45
SymbolmA@ m滤膜过滤后，准确吸取10.0 mL尿样于25.0 mL玻璃试管中，加入10.0 mL水解酶溶液（含3000 U β-葡萄糖苷酸酶和70 U芳基硫酸酯酶），加入50
SymbolmA@ L 200
SymbolmA@ g/L的3-羟基菲13C同位素内标，混合放入37 ℃水浴中避光水解4 h，得水解液。然后用5.0 mL 甲醇、5.0 mL 水活化3 mL （500mg） C18固相萃取小柱（小柱不能流干），将水解液通过C18固相萃取小柱富集，用1.0 mL 水清洗柱，流干后，继续抽干5 min，再以1.0 mL甲醇缓慢洗脱后，以甲醇定容至1.0 mL，混匀后进入LC-MS/MS测定。
2.3 色谱-质谱条件
Waters Symmetry C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5
SymbolmA@ m）；流动相为乙腈-0.2%氨水（72∶27, V/V）等度淋洗；流速500
SymbolmA@ L/min；进样量20
SymbolmA@ L。
质谱采用电喷雾离子源（ESI）, 负离子扫描方式，选择反应监控（SRM）; 喷雾电压4 kV，毛细管温度300 ℃，鞘气11 arb，辅助气4 arb， 各化合物的质谱采集参数见表2。
3 结果与讨论
3.1 色谱和质谱条件的选择
本实验选用了Symmetry C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5
SymbolmA@ m）、Symmetry C18 色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5
SymbolmA@ m）、Symmetry C8 色谱柱（150 mm×2.1 mm， 3.5
SymbolmA@ m）和Atlantis dC18 色谱柱（150 mm×2.1 mm， 3
SymbolmA@ m）进行实验。结果表明，150 mm色谱柱对某些同分异构体的分离效果较差，而Symmetry C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5
SymbolmA@ m）可将9种OH-PAHs完全分离，故本实验选用Symmetry C18 色谱柱作为分析柱。在流动相的选择中，研究了乙腈-水及乙腈-0.2%氨水的等度淋洗和梯度淋洗，发现OH-PAHs在乙腈-0.2%氨水（72∶27, V/V）等度淋洗时同样可以达到梯度淋洗的效果，而且还减少了梯度淋洗的平衡时间，从而缩短了样品分析时间。在液相色谱检测OH-PAHs时常用甲醇-水为流动相，但在本实验中，甲醇-水在负离子模式下测定的噪声比较大，选用乙腈-水后，噪声降低，但检测的灵敏度仍然较差。在流动相中加入0.2%氨水后，通过去除OH-PAHs流动相中的H.＋, 从而提高了灵敏度和选择性。
分别将9种OH-PAHs的标准溶液进行MS分析，确定2-羟基萘、1-羟基萘、2-羟基芴、3-羟基菲、3-羟基屈、6-羟基屈、1-羟基苯并[a]蒽、1-羟基芘、9-羟基苯并[a]芘和3-羟基菲13C内标的分子离子峰[M
Symbolm@@ H].
Symbolm@@ 分别是m/z 143，143，181，193，217，243，243，243，267和199。在较低的能量下分别对各个分子离子进行二级质谱扫描，确定各物质的特征离子峰。在测定中，采用选择反应监控（SRM）模式进行数据采集，具体参数见表2，9种OH-PAHs的标准色谱图见图1。
Fig．1 Chromatogram of mixed standard solution
A . 2-羟基萘 （2-OHN）； B． 1-羟基萘（1-OHN）； C. 2-羟基芴 （2-OHF） ；D . 3-羟基菲（3-OHPH）；E. 3-羟基菲13C内标 （3-OHPH 13C）； F. 1-羟基芘 （1-OHP）；G. 3-羟基屈（3-OHC） ；H. 6-羟基屈 （6-OHC）；I. 1-羟基苯并[a]蒽（1-OHBAA）；J. 9-羟基苯并[a]芘 （9-OHBAP）
3.2 前处理条件的选择
在很多测定OH-PAHs的方法中，都将洗脱液浓缩后进行测定。为了比较浓缩对实验结果的影响，取2份平行尿样，分别加入等量的标准品， 在37 ℃避光水解4 h，将水解液通过C18固相萃取小柱富集、清洗后，一份用1.0 mL甲醇进行洗脱,定容至1.0 mL后直接测定。另一份用5.0 mL甲醇进行洗脱后放入浓缩仪中，在35 ℃下真空浓缩后，定容至 1.0 mL后，测定。结果表明，样品经过浓缩仪浓缩后，由于部分目标化合物会随着溶剂一同蒸发，所以导致1-羟基萘、2-羟基萘损失严重，而其它OH-PAHs也有损失。因此，本实验省略浓缩步骤，直接进样，既节约了时间，又可以达到良好实验效果。
由于尿样的本底比较复杂，为了清除部分杂质，提高实验的灵敏度，本实验在水解液通过C18固相萃取小柱富集后，增加了清洗过程。为最大程度洗去杂质，减小OH-PAHs的损失，分别使用甲醇-水（1∶1, V/V）、甲醇-水（1∶2, V/V）和纯水进行清洗，结果表明，用甲醇-水（1∶1, V/V）和甲醇-水（1∶2, V/V）清洗，目标化合物损失都较大，纯水清洗效果较好。本实验采用1.0 mL纯水清洗萃取柱中的杂质。空白尿样和加标尿样的色谱图如图2和图3所示。
3.3 稳定性实验
选用浓度为30.0
SymbolmA@ g/L标准溶液，在常温下避光保存，每隔2 h测定其浓度。结果表明，处理后的样品在24 h内测定，其浓度无明显变化。
3.4 线性方程和检出限
用OH-PAHs混合标准溶液配制0.00， 1.00， 3.00， 5.00， 10.0， 30.0， 50.0和100
SymbolmA@ g/L的标准溶液，分别加入相同浓度的3-羟基菲13C内标（内标浓度为10.0
SymbolmA@ g/L），在设定条件下，分别取样20
SymbolmA@ L，注入LC-MS/MS中进行分析，以标准系列峰面积与内标峰面积之比对其质量浓度做线性回归方程，以3倍信噪比计算检出限。结果表明，在1.0～100
SymbolmA@ g/L浓度范围内具有良好的线性结果（表3）。
3.5 回收率和精密度
取3份同一尿样的平行样品，加入一定浓度的混合标准溶液，经前处理后，分别进样，进行OH-PAHs的加标回收实验。取6份同一尿样的平行样品，经前处理后，分别进样，进行精密度实验，实验结果见表4。由表4可知，方法回收率为79.0%～119.8%；相对标准偏差为4.3%～12.4%。
3.6 样品测定
应用本方法测定了260份样品，其中2-羟基萘的检出率为77.8%，平均浓度为46.9
SymbolmA@ g/L; 1-羟基萘的检出率为38.8%，平均浓度为2.43
SymbolmA@ g/L; 1-羟基芘的检出率为15.4%，平均浓度为0.28
SymbolmA@ g/L。表明本方法可用于尿中多环芳烃代谢物的检测要求。
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Simultaneous Determination of Nine Phenolic Metabolites of
Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Human Urine by
Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
DING Chang-Ming, JIN Yin-Long, LIN Shao-Bin.*
（Institute for Environment Hygiene and Health Related Product Safety,
Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100021， China）
Abstract A method was developed for the simultaneous determination of nine phenolic metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons （OH-PAHs） in human urine, i.e. 2-hydroxynaphthalene, 1-hydroxynaphthalene, 2-hydroxyfluorene, 3-hydroxyphenanthrene, 1-hydroxypyrene, 3-hydroxychrysene, 6-hydroxychrysene, 1-hydroxybenz［a］ anthracen, 9-hydroxybenzo［a］ pyrene by solid-phase extraction-liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）. After adding the internal standard （13C3-Hydroxyphenanthrene）, the urine samples were hydrolyzed by enzyme （pH 5.0） at 37 ℃ for 4 h, then cleaned up and concentrated on C18 SPE column, and then the targeted compounds were analyzed by LC-MS/MS under negative ion mode using Waters symmetry C18 column as analyzed column. The mobile phase was CH3CN∶NH3•H2O （0.2%）＝72∶27 （volume ratio）. The spray voltage was 4 KV. The capillary temperature was 300 ℃. The linear ranges were 0.90－100
SymbolmA@ g/L. The correlation coefficients were 0.9970－0.9990. The detection limits were 0.04－0.90
SymbolmA@ g/L. The recoveries were 79.0%－119.8%. The relative standard deviations were 4.3%－12.5%（n＝6）. The method has been used for the simultaneous determination of nine phenolic metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons （OH-PAHs） in human urine.
Keywords Liquid chromatography tandem mass spectrometry; Urine; Phenolic metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons
（Received 25 April 2011; accepted 14 June 2011）