全反式维甲酸对荷瘤Wistar大鼠生存期的 影响

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【摘要】 目的 研究全反式维甲酸对荷瘤鼠生存期的影响及其机制。方法 建立wistar大鼠脑内c6胶质瘤模型，待肿瘤生长至第7天，随机将荷瘤鼠分为维甲酸治疗组和对照组。于接种后的第22天，免疫组化检测各组p27kip1蛋白的表达并观察动物生存期。结果 与对照组相比，治疗组动物p27kip1蛋白的表达增高（p<0.05），生存期延长（p<0.05），两者呈正相关。结论 全反式维甲酸延长动物生存期的机制同上调p27kip1蛋白的表达有关。p27kip1蛋白的表达高低可作为判断胶质瘤预后的指标。

【关键词】 胶质瘤 全反式维甲酸 p27kip1 生存期

全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病的成功，展现了其治疗肿瘤的良好前景。近年来，国内外学者已开始探讨该疗法在胶质瘤治疗中的潜在用途，但多限于离体细胞或者皮下模型实验。本实验通过对脑内接种有c6胶质瘤的wistar大鼠实施全反式维甲酸治疗，观察生存期并探讨其机制，以便为临床应用提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

1.1.1 细胞来源 c6细胞是一种经n?亚硝基甲脲诱发的高度恶性的大鼠脑胶质瘤（购于中科院上海细胞所）。

1.1.2 培养方法 c6细胞在含有10％的新生小牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素的dmem培养基中，5％co2、37℃条件下培养。

1.2 动物模型建立

1.2.1 动物 健康wistar大鼠，雌雄不限，鼠龄4～6周，体重150～200g，常规喂养，共40只。

1.2.2 方法 wistar大鼠经10％的水合氯醛3ml/kg麻醉后，固定于立体定向仪上，于大鼠右顶叶皮质s1区（前囟后1mm，矢状缝旁3mm）接种c6胶质瘤细胞1×106/10μl，微量注射器注入[1]。

1.3 动物分组及治疗的实施

接种c6细胞后第7天，将荷瘤鼠随机分为对照组和维甲酸治疗组，每组20只。对照组：无水乙醇和磷酸盐缓冲液按1∶9配制，每天1ml腹腔注射，连续2周。全反式维甲酸治疗组：无水乙醇和磷酸盐缓冲液按1∶9配制后，加入全反式维甲酸（购自美国sigma公司），浓度为1mg/ml，每天1ml腹腔注射，连续2周[2]。

1.4 免疫组化检测p27kip1蛋白的表达

接种c6细胞后第22天，每组随机取10只大鼠，经10％的水合氯醛3ml/kg麻醉后，经左心室插管，剪开右心耳，300ml生理盐水快速冲洗后，以4％多聚甲醛（4℃，ph值7.4）300ml灌注固定，先快后慢。此后开颅取出瘤块于4％多聚甲醛中进一步浸泡固定72h，常规石蜡包埋。每个蜡块厚4μm行连续切片，每20张取1张，裱于玻片上凉干备用。将石蜡切片常规脱蜡至水，用单克隆鼠抗p27kip1（美国santa cruz公司），工作浓度1∶100，采用免疫组化法（sp法）进行检测，步骤参考试剂盒说明书操作。用已知的阳性切片作阳性对照，以0.01mmol pbs代替一抗作阴性对照。在400倍镜下，每3张切片计数单位视野阳性细胞占细胞总数百分比，至少计数1 000个肿瘤细胞，阳性细胞所占比率为蛋白表达百分比。

1.5 观察动物生存期

直接记录动物生存时间，绘制生存率曲线。

1.6 统计学方法

采用spss10.0统计分析软件，p27kip1蛋白的表达采用t检验比较其差异。各组大鼠生存期用k?m乘积极限法及时序检验分析。用spearson相关分析法对p27kip1蛋白阳性表达率和生存期进行相关性分析。

2 结果

2.1 p27kip1蛋白免疫组化检测

p27kip1蛋白表达位于肿瘤细胞核内、阳性细胞呈棕黄色,图1略。对照组及治疗组p27kip1蛋白表达阳性细胞百分数分别为（4.81±0.72）%、（17.05±1.88）%（p<0.05）。

2.2 对照组及治疗组动物中位生存期分别为（37.00±1.55）天、（46.00±1.58）天（p<0.05）。生存率曲线，见图2。

图2 各组动物生存率曲线

2.3 经spearson相关分析表明p27kip1蛋白阳性表达率和生存期呈正相关（r=0.596，p<0.05）。

3 讨论

全反式维甲酸作为一种脂溶性化合物，可通过血脑屏障，并在脑组织内浓集，这是其应用于胶质瘤治疗的基础。本实验通过检测p27kip1蛋白的表达结果显示，维甲酸治疗组p27kip1蛋白的表达明显高于对照组，两者差异有统计学意义。研究表明维甲酸引起p27kip1蛋白水平的增加与以下多种因素有关：降低细胞内泛素蛋白酶系统中相关蛋白质的表达和(或)活性[3]，保持p27kip1蛋白低磷酸化状态[4]。我们推测维甲酸引起大鼠c6脑胶质瘤p27kip1蛋白水平的增加也与此有关。目前的研究认为p27kip1蛋白可以和细胞周期素及cdk广泛结合，抑制g1期相关的cyclind?cdk4、cycline?cdk2等的活性，对细胞周期起负性调节作用，从而抑制细胞增殖。这在以下正反两实验中可得到证实：p27kip1缺乏的小鼠同正常小鼠相比,许多器官细胞数目增多,从而体积增大 [5]；而在体外培养的恶性肿瘤细胞系中转染，p27kip1蛋白过表达导致细胞增殖抑制[6]。本研究前期实验[7]已证实维甲酸治疗可缩小肿瘤体积，我们推断这也同维甲酸上调p27kip1蛋白的表达有关。众所周知，瘤体的缩小是提高生存期的重要因素，因此我们认为全反式维甲酸治疗延长荷瘤鼠生存期的机制在于上调p27kip1蛋白的表达，抑制细胞增殖，缩小肿瘤体积。本研究还表明p27kkip1蛋白的表达同生存期呈正相关，因此认为p27kip1蛋白的表达高低可作为判断预后的指标。

【参考文献】

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[5] nakayama k,ishida n,shirama m,et al.mice lacking p27kipl display increased body size,multiple orgen hyperplasia,retinal dysplasia,and pituitary tumors[j]. cell, 1996, 85(5):707?720.

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[7] 付锐，王伦长，涂汉军，等.全反式维甲酸诱导分化大鼠c6脑胶质瘤的实验研究[j].肿瘤防治研究，2005，32（2）：73?75.