金荞麦银纳米粒的制备及其工艺优化研究
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[摘要]该研究以金荞麦提取液为还原剂和稳定剂制备银纳米粒，并通过考察金荞麦粉末提取时间、银纳米粒合成温度、金荞麦提取液加入量、AgNO3溶液的浓度等不同因素，优选金荞麦银纳米粒形成的最佳工艺，并采用红外光谱仪（FT-IR）、透射电镜（TEM）、动态激光散射（DLS）、X-射线粉末衍射（XRD）对所制银纳米粒进行结构表征和形态学考察。结果显示，制备银纳米粒最佳条件为金荞麦粉末煮沸5 min，提取液（质量浓度0.1 g・mL-1）与1 mmol・L-1 AgNO3体积比1∶10，反应温度25 ℃，反应时间3.5 h。所得银纳米粒形态圆整，分布均匀、性质稳定，平均粒径约（27±2.6） nm，Zeta电位（-34.3±3.2） mV。结果表明该研究所建立的以中药提取液制备银纳米粒的绿色合成方法稳定可行。
[关键词]金荞麦提取液；AgNO3；银纳米粒；条件优化
银纳米粒是由几个到几十个银原子团聚在一起，粒径位于1～100 nm的银簇[1]。银纳米粒由于具有很高的化学活性和表面能而显示出独特的热、电、光、声、磁、力学性能和催化性能[2]，这也决定了银纳米粒在许多领域均有应用[3]，特别在医学领域的应用近年来越来越受到人们的关注。在医学领域银纳米粒子具有抗多种微生物的性能，且银纳米粒子不会引起病原体产生抗体或发生突变，不会干扰人体的正常免疫功能[4-5]，因此制备安全有效的银纳米粒成为医学领域的研究热点。银纳米粒合成方法主要有物理法和化学法，例如，电子束蒸发沉积法、光催化还原法、射线法和激光融化法、化学还原法、电化学法等[5-8]，然而这些合成方法大部分高能耗、低收率，化学试剂易残留在银纳米粒表面，同时易污染环境，有一定的毒副作用[9]。目前，绿色合成银纳米粒的方法已经受到国内外研究人员的广泛关注，如已报道利用白藜[10]、柑橘皮[11]、柠檬叶[12]等合成银纳米粒，这种绿色合成方法成本低，环境友好，易于大规模生产，且合成的银纳米粒比较稳定不易团聚，因此这种合成方法的优势吸引着许多研究者对更多的天然还原剂进行发掘。
金荞麦为蓼科植物金荞麦Fagopyrum dibotrys （D.Don） Hara的干燥根茎，收载于2010年版《中国药典》一部[13]，为常用中草药，具有抗菌、镇咳、祛痰、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫功能等药理作用。金荞麦中主要含有3，4-二羟基苯甲酸、没食子酸、木犀草素、槲皮素等多酚类以及三萜类、甾体类、苷类等化学成分[14]，研究表明植物中含有的多羟基化合物如黄酮类等物质具有还原作用[8，15]，能将金属阳离子还原成金属单质，因此本文将金荞麦提取液作为还原剂，与AgNO3溶液反应，研究由金荞麦提取液合成银纳米粒的可行性，探究反应条件对金荞麦银纳米粒形成的影响，并对优选条件下形成的金荞麦银纳米粒进行理化性质的表征。
1材料
D8 ADVANCE 型X射线衍射仪（德国布鲁克公司）；Nicolet IS-10 型傅立叶变换红外光谱仪（ThermoFisher）；Tecnai 12 型透射电子显微镜（荷兰飞利浦公司）；Nano-ZS型马尔文粒径测定仪（英国马尔文公司）；UV-1800 型紫外-可见分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）；benchtop 型台式冻干机（VirTis）；TG16W 台式高速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；TDZ5B-WS 台式离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；FA2104 型1/1万天平（上海良平仪器仪表有限公司）。
金荞麦（安徽井泉集团中药饮片有限公司）、AgNO3 （南京化学试剂有限公司，分析纯，纯度>99.8%）、蒸馏水。
2方法与结果
2.1金荞麦提取液的制备 取金荞麦药材粉末（过60目筛）30 g，加水300 mL，煮沸不同时间（2，5，15，30，60 min），冷却至室温后纱布粗滤，将粗滤液抽滤，所得滤液用蒸馏水定容至300 mL，即1 mL提取液含0.1 g生药，将药液4 ℃条件下保存，备用。
2.2AgNO3溶液的制备 精密称取425 mg的AgNO3于25 mL量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度线，即得100 mmol・L-1 AgNO3 溶液。制备银纳米粒时用蒸馏水将其适当稀释，即得不同浓度的AgNO3溶液。
2.3金荞麦银纳米粒溶液的制备 将10 mL金荞麦提取液边搅拌边缓缓加入到100 mL 1 mmol・L-1 AgNO3溶液中，常温下放置3.5 h，将混合溶液4 000 r・min-1离心15 min，去除溶液中大粒子杂质，取离心后的上清液，13 000 r・min-1.离心15 min，去除上清液，将沉淀用蒸馏水反复洗涤至少3次，以去除银纳米粒上的Ag+离子，然后加入适量蒸馏水，超声约20 min将其充分分散，得金荞麦银纳米粒溶液。
2.4金荞麦粉末提取时间对金荞麦银纳米粒形成的影响 分别取不同煮沸时间药液适量，运用福林试剂法测定各药液中总多酚含量，并按上述银纳米粒溶液的制备方法制备6组金荞麦银纳米粒溶液，取适量银纳米粒溶液用紫外-可见分光光度计在300～800 nm进行波长扫描，并记录金荞麦银纳米粒溶液在最大吸收波长处的吸光度。金荞麦粉末煮沸2，5，15，30，60 min，所得药液总多酚质量分数分别为14.28%，19.83%，18.76%，18.11%，18.07%；不同煮沸时间的提取液所制银纳米粒在最大吸收波长处吸光度分别为0.623，0.897，0.851，0.829，0.810，见图1。结果表明，金荞麦粉末煮沸5 min时，多酚类作为金荞麦中主要的还原性成分含量最高，且银纳米粒吸光度最大，这也说明此条件下合成的银纳米粒量最多，故金荞麦粉末最佳煮沸时间为5 min。
2.5提取液的用量对金荞麦银纳米粒形成的影响 将2.5，5，10，25，50，75 mL煮沸时间为5 min的药液（以下所用药液煮沸时间均为5 min）分别加入到6份100 mL 1 mmol・L-1AgNO3溶液中，即提取液与AgNO3溶液体积比为1∶40，1∶20，1∶10，1∶4，1∶2，3∶4。按2.3项下条件对每份样品离心-洗涤-超声处理得银纳米粒溶液，考察金荞麦银纳米粒溶液在300～800 nm吸收情况，结果见图2。相同条件下，当100 mL 1 mmol・L-1AgNO3溶液中加入金荞麦提取液的量为2.5，5，10 mL时，银纳米粒吸光度随着提取液加入量的增加而升高，但当提取液的加入量增加到25，50，75 mL时，随着提取液量的增加吸光度反而降低，表明提取液的加入量为10 mL时即与1 mmol・L-1 AgNO3体积比为1∶10时吸光度最大，合成的银纳米粒量最多，故选择金荞麦提取液与AgNO3体积比为1∶10。
2.6AgNO3浓度对金荞麦银纳米粒形成的影响 分别取5份10 mL金荞麦提取液，加入到100 mL 浓度分别为0.1，0.5，1，1.5，2 mmol・L-1的AgNO3溶液中，按上述银纳米粒溶液制备方法制备银纳米粒，将所制银纳米粒溶液稀释1倍，考察其在300～800 nm吸收情况，结果见图3。相同条件下，当确定提取液与AgNO3体积比为1∶10时，随着AgNO3浓度增大吸光度增大，AgNO3浓度为2 mmol・L-1时吸光度最大，但超过1.5 mmol・L-1，紫外半峰宽明显增大，银纳米粒不稳定，易团聚，粒径增大。故本实验选择AgNO3浓度为1 mmol・L-1。
2.7合成温度对金荞麦银纳米粒形成的影响 取金荞麦粉末煮沸5 min药液适量，与AgNO3溶液体积比为1∶10，制备二者的混合液，将混合液均分5份分别放置在4，25，40，50，60 ℃温度下反应，并在30，60，90，120，180，240，360 min时间点分别对5份混合液各取样10 mL，按2.3项下方法对每份样品离心-洗涤-超声处理得银纳米粒溶液，测定金荞麦银纳米粒溶液在最大吸收波长处的吸光度，结果见图4。温度越高银纳米粒合成速率越快，即较高温度条件下能缩短银纳米粒的合成时间。50 ℃和60 ℃条件下约在150 min时银纳米粒合成量趋于完全，25 ℃和40 ℃条件下约在210 min时银纳米粒合成量最高，随后达到稳定。但与25 ℃条件下相比较高温度下（40，50，60 ℃）银纳米粒的合成量较少，推测随时间延长金荞麦提取液中部分还原性成分被破坏，提取液还原能力减弱，银纳米粒合成量降低，因此银纳米粒的合成温度选择25 ℃。
2.8验证试验 煎煮3份金荞麦药液，煮沸时间均为5 min，分别与1 mmol・L-1 AgNO3溶液按1∶10的体积比在25 ℃条件下反应3.5 h，将混合溶液4 000 r・min-1离心15 min，取离心后的上清液13 000 r・min-1离心15 min，用蒸馏水洗涤沉淀3 次，再用适量蒸馏水溶解，超声20 min得金荞麦银纳米粒溶液，经检测，3批样品溶液在300～800 nm的吸收变动范围小于3%，见图5，由结果可知该工艺稳定性、重复性良好。
2.9金荞麦银纳米粒的TEM表征 取少量金荞麦银纳米粒溶液，滴加到铜网上，干燥后，用 Tecnai 12 型透射电镜，观察金荞麦银纳米粒的外观形态及粒径分布。为了更直观地反应金荞麦银纳米粒的粒径分布情况，对其透射电子显微镜图进行分布统计，结果见图6。25 ℃下，金荞麦提取液与1 mmol・L-1 AgNO3体积比为1∶10时还原制得的银纳米粒近球形，偶见三角形，粒径范围为6.69～30.63 nm，平均粒径为18.98 nm，分散均匀，未发生团聚。银纳米粒黑色粒子外包裹有灰色物质，由红外图谱结果推测这种物质可能是键合在银纳米粒表面的金荞麦有效成分。
2.10金荞麦银纳米粒的动态激光散射（DLS）表征 将样品溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤，用DLS测其粒径分布及Zeta电位，结果见图7。银纳米粒平均粒径为（27.15±2.6） nm，分散指数（PDI）为0.156，Zeta电位为（-34.3±3.2） mV。已知粒径PDI越小粒子分散越均匀，Zeta电位绝对值越高体系越稳定，实验结果中PDI小于0.2，Zeta电位
2.11金荞麦银纳米粒的XRD表征 将金荞麦银纳米粒溶液冷冻干燥得粉末，在管电压40 kV，管电流40 mA，2θ为10°～80°，X射线入射波长Cukα为1.540 6条件下进行XRD表征，结果见图8。金荞麦银纳米粒溶液经冷冻干燥后的XRD表征结果，金荞麦银纳米粒的XRD有4个明显衍射峰即38.175，44.305，64.523，77.535。此结果与PDF2卡中04-0783数据一致，表明银纳米粒制备成功。Scherrer公式：D=Rλ/βcosθ，式中，D为粒子直径，R为Scherrer常数（0.89），λ为入射X射波长，β为衍射峰的半高峰宽（rad），θ为衍射角。利用Scherrer公式计算银纳米粒粒径为18.995 nm，与TEM粒径统计结果相符。
2.12金荞麦银纳米粒的FT-IR表征 将金荞麦银纳米粒溶液冷冻干燥得粉末，在4 000～1 000 cm-1 进行红外扫描。由银纳米粒红外图谱结果可知，在3 234.90，2 919.46，1 608.48，1 435.57，1 074.27，598.89 cm-1处有明显吸收，3 234.90 cm-1为νOH吸收峰，2 919.46 cm-1为νC-H吸收峰，1 608.48，1 435.57 cm-1为νC=C或νC=N吸收峰，1 074.27 cm-1为β=C-H吸收峰，598.89 cm-1为γC-H或γO-H吸收峰，这些吸收峰表明银纳米粒表面可能含有黄酮类和萜类成分等[16-17]。由于银纳米粒表面含有金荞麦中的化学成分，这些成分分散银纳米粒，使银纳米粒不易团聚，表现出很好的稳定性。故本研究中金荞麦提取液不仅是还原剂同时也是稳定剂 [18]。
2.13金荞麦银纳米粒稳定性考察 将优化条件下所制金荞麦银纳米粒常温放置2个月，并分别测定其与当天所制备金荞麦银纳米粒溶液及金荞麦药液三者在300～800 nm吸收情况，初步考察金荞麦银纳米粒溶液的稳定性，结果见图9。所制银纳米粒常温放置2月后，吸光度降低不超过2%，紫外-可见吸收稳定，表明以金荞麦提取液为还原剂在优化条件下所制银纳米粒稳定性较好。
3讨论
本文采用中药金荞麦提取液作为还原剂及稳定剂成功合成了银纳米粒，合成方法迅速高效、绿色安全、稳定可行。金荞麦银纳米粒的成功制备，表明利用中药制备银纳米粒的可行性。
经实验测定银纳米粒制备前后金荞麦药液中多酚类物质含量由19.83%降低至4.79%，多酚类物质的含量降低75.8%，还原前后多酚类物质含量变化显著，说明金荞麦中多羟基化合物具有较好的还原能力可用于还原银离子制备银纳米粒。中药种类繁多，含有较多多羟基化合物的中药可作为还原剂制备银纳米粒，本研究为今后更多中药还原剂的发掘提供了参考。
实验中可观察到银纳米粒形成前后溶液颜色变化明显，据文献报道这主要是银纳米粒表面等离子体共振的原因[15]，所制备的银纳米粒多呈球状，粒径在6.69～30.63 nm，这是由于金荞麦提取液中含有多种还原性成分，还原Ag+的速率不同，致形成的银纳米粒粒径存在一定差异。
由图2结果分析可知，反应物质的量变会引起吸收峰位变化，当 AgNO3浓度不变，随提取液量的增加吸收峰位由445 nm蓝移到436 nm，这是由于金荞麦提取液既为还原剂又是稳定剂，当其加入量增加时所形成的银纳米粒不易团聚，粒径减小，因此等离子体共振吸收峰向短波方向移动。当金荞麦提取液的用量不变，随AgNO3的浓度增加吸收峰位由437 nm红移到444 nm，这是由于稳定剂的量相对不足，形成的银纳米粒易团聚，粒径增大，因此等离子体共振吸收峰向长波方向移动[19]。
据R M Gengan等[20]报道，利用具有抗肿瘤作用的合欢皮制备的银纳米粒具有很好的抗肿瘤作用，且对正常外周淋巴细胞无细胞毒性。本实验红外图谱表明金荞麦银纳米粒上包裹有金荞麦化学成分，且中药金荞麦具有明显抗肿瘤作用，因此金荞麦银纳米粒是否具有协同抗肿瘤作用，有待进一步研究。
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Study on biosynthesis of silver nanoparticles using Fagopyri Dibotryis
Rhizoma extract and optimization of synthesis conditions
SUN Wen-jie1， QU Ding2， CHEN Yan1，2*， YUAN Ling2， HE Jun-jie1
（1. Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Meteria Medica， Jiangsu Provincial
Academy of Chinese Medicine， Nanjing 210028， China；
2.Nanjing University of Chinese Medicine， Affiliated Hospital on Integration of
Chinese and Western Medicine， Nanjing 210023， China）
[Abstract] Silver nanoparticles were synthesized from the extract of Fagopyri Dibotryis Rhizoma and the optimization of synthesis was studied. The absorbance of UV-visible spectroscopy was determined under the different influencing factors such as extracting time of Fagopyri Dibotryis Rhizoma powder， reation temperature of synthesis， volume of Fagopyri Dibotryis Rhizoma extract and concentration of AgNO3 to seek the optimization conditions. By means of FT-IR， TEM， DLS and XRD， the silver nanoparticles were characterized. The results showed that when the boiling time of Fagopyri Dibotryis Rhizoma powder was 5 min， resultant temperature was 25 ℃， the volume ratio of 0.1 g・mL-1 Fagopyri Dibotryis Rhizoma extract and 1 mmol・L-1AgNO3 was 1 to 10， and the reaction time was 3.5 h， the obtained silver nanoparticles had mean size about 27 nm and Zeta potential about -34.3 mV with good uniformity and dispersivity. Therefore， the green synthesis method of silver nanoparticles using extract of traditional Chinese medicine is stable and feasible.
[Key words] Fagopyri Dibotryis Rhizoma extract； AgNO3； silver nanoparticles； condition optimization
doi：10.4268/cjcmm20140911