脑灵汤对老年性痴呆大鼠智力及其相关因素的影响

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摘要：目的探讨脑灵汤对老年性痴呆大鼠的干预机制。方法采用Y－迷宫测试大鼠的智力；采用生化法检测大鼠血清总胆固醇(TC)含量和放射免疫法(RTA)测定大鼠脑淀粉样前蛋白(APP)、β－淀粉样肽(Ap)含量。结果 脑灵汤组能明显改善老年性痴呆大鼠智力，其学习记忆能力明显提高(P＜0.05)；血清总胆固醇及脑内APP、Aβ含量显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.01)。结论脑灵汤对老年性痴呆大鼠有明显的干预作用，其机制可能与降低血清总胆固醇、抑制APP的产生、减少脑组织Aβ含量，从而提高其智力能力。

关键词：脑灵汤；老年性痴呆大鼠；淀粉样前蛋白；β－淀粉样肽

中图分类号：R749.1 R255.2　文献标识码：A　文章编号：1672―1349(2007)04―0310―03

老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AID)是一种以进行性智能减退为主要特征的老年神经系统退行性疾病。老年斑是其主要病理性特征之一。临床表现为记忆功能丧失、智力减退和行为人格退化。脑病理研究发现，β淀粉样肽(Aβ)是老年斑的核心成分，AD病人脑组织内Aβ明显增多，并形成大量的老年斑。老年斑、神经原纤维缠结和血管壁淀粉样变是AD大脑的特征性病理改变，而Aβ是老年斑和血管壁淀粉样变性的主要成分[1，2]。为此，本实验从益肾健脾、祛痰清瘀立法组方，观察脑灵汤对AD大鼠血清总胆固醇(TC)及其脑内淀粉样前蛋白(APP)、Aβ含量的影响，从而探讨其防治AD的作用机制，为临床治疗AD提供理论依据。

1　材料与方法

1.1 实验动物选用健康4月龄SD(Spragu－Dawley)大鼠72只(中南大学湘雅医学院实验动物中心提供)，雌雄各半，体重180 g～220 g。合格证号[(湘)－2004－0013]领回后在实验室动物房喂养，喂养期间自由饮水和进食，保持充足的光照和通风。

1.2　实验药物及主要试剂脑灵汤浓缩液(由何首乌、白参、红景天等八味药组成)，湘雅二医院制剂科配制，每毫升成药液含生药2.9 mg。舒降之(辛伐他汀片)：用前用双蒸水经超牛细胞粉碎机制成浓度4 g/L的混悬液，药物配制后置4℃冰箱保存备用，用前摇均(杭州默沙中制药有限公司，20 mg×7粒)。APP的N末端抗体由Sigma公司生产；Aβ试剂盒天津九鼎医学生物工程有限公司生产，血清TC试剂盒首都医科大学首医临床科技中心提供。

1.3 主要仪器Y型电迷宫箱(中南大学湘雅医学院神经生物中心提供)，台式高速冷冻离心机(湖南仪器仪表总厂离心机厂生产)，微机多探头7计数器(上海泸西分析仪器厂生产)，全自动生化分析仪(荷兰威图Selectrac生产)，流式细胞仪(美国BECKMAN公司生产)，紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组共筛选出72只SD大鼠，再将这72只大鼠随机分为对照组、模型组、西药组(舒降之组)、中药组(脑灵汤组)，每组各18只。

1.2.2 模型制备实验大鼠喂饲高胆固醇饲料(1％胆固醇)，2周后检测血清总胆固醇含量，给药组开始给药，持续8周，进行学习记忆测试，然后取血和脑组织，进行各项指标观察，进行学习记忆测试并取血和脑组织进行检测。对照组大鼠喂饲普通饲料。

1.3 观察指标

1.3.1　大鼠学习记忆能力检测 行为学测试于AID模型建立前后及脑灵汤／舒降之处理各时间段(20d及30 d)进行，均予Y－迷宫测试，方法：将大鼠放入Y－迷宫箱中，适应5min，使其熟悉－迷宫箱的3个臂的内部结构，然后从1个臂开始随机测试，给(30～70)V，电流(0.5～0.7)mA，电击后大鼠逃避至安全区为正确反应，否则为错误反应。每测1次休息30 s，测10次休息5 min。大鼠学习记忆能力以连续10次测试中有9次为正确反应时，所需的电击次数表示。数值越小表示大鼠的学习记忆能力越好；数值越大表示大鼠的学习记忆能力越差，记录每只大鼠学会逃避电刺激所需的次数。若次数超过30次则不再测试，并以30次为最大值记数。

1.3.2　脑APP含量测定采用放射免疫法(RTA)：实验大鼠采血后，断头处死，手术迅速将脑组织取出，冰台上快速分离大鼠左、右半大脑，除去小脑及脑桥。用Tris－HCI缓冲液匀浆，10 000 r/min离心10 min。取上清液检测APP含量(ng/mg)。严格按照天津九鼎医学生物工程有限公司APP试剂盒说明书操作，结果由γ计数器得到校正的APP含量。

1.3.3 脑Aβ含量测定 断头处死后，冰台上快速分离大鼠左、右半大脑，除去小脑及脑桥，加入2.5倍量的冰生理盐水，在冰浴下超声波破碎制成40％的匀浆，4℃低温离心机中10000 r/min离心10 min，取上清液用放免法测Aβ的含量，按Aβ试剂盒方法操作。

1.3.4 血清TC的测定采用生化法：大鼠于末次给药后1 h腹主动脉放血，4℃放置4 h后，3000 r/min离心20 min，取上清液，按国产试剂法，取10uL血清1.0 mL试剂，37℃反应10 min，于荷兰威图SelectraE全自动生化测定仪在520 nm比色，以试剂空白校零，计算公式为：样品中胆固醇含量(mmol/L)=A测定／A标准x标准浓度。

1.4　统计学处理采用SPSS 11.5进行数据分析。实验数据以均数±标准差

表示，配对t检验进行组内分析，造模前后学习记忆成绩与对照组的比较采用t检验；药物对脑APP含量、脑Aβ含量和血清总胆固醇含量的影响及各组治疗后学习记忆成绩所得数据用单因素方差分析，a=0.05。

2　结　果

2.1 脑灵汤对老年痴呆大鼠学习记忆的影响(见表1) 治疗后20 d、30 d各组大鼠电迷宫实验学习记忆能力测试比较，记录模型组和对照组大鼠造模前后Y－迷宫学习记忆成绩。结果说明，喂饲高胆固醇饲料后大鼠学习记忆功能明显减退，提示模型复制成功。但治疗用药后，脑灵汤组和舒降之组可明显改善动物的学习记忆力，而两组之间无明显差异。

2.2　各组大鼠大脑组织匀浆APP、Aβ含量的比较在治疗8周后断头取大鼠大脑组织，检测其APP、Aβ含量，结果显示：对照组、脑灵汤组、舒降之组脑APP、Aβ含量和模型组比较均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。脑灵汤组与舒降之组相比较，脑APP、Aβ含量有统计学意义(P＜0.05)。详见表2。

2.3 脑灵汤对大鼠血清TC水平的影响 造模前受试动物的血脂水平均为正常。造模2周后，模型组与对照组比较，血清TC明显升高(P＜0.01)，表明高胆固醇血症造模成功。与模型组比较，脑灵汤组、舒降之组血清TC均明显降低(P＜0.001)。

与舒降之组比较，脑灵汤组血清TC明显降低(P＜0.05)。详见表3。

3　讨　论

中医古籍没有老年性痴呆的病名，根据本病的常见临床表现，应属中医“呆痴”“郁证”等范畴。祖国医学认为AID的发生多与肝肾不足、脑髓不充，或饮食失宜，气血虚弱，脑神失养有关；此外，中毒、外伤等损伤脑脏，迁延日久火邪、痰浊、瘀血阻塞清窍均可导致AD发生，出现失忆、失认失算、失断(判断)等临床表现。

学习智能障碍是AD的主要症状。目前研究AD所用的模型大多为各种理化方法所致的学习记忆障碍模型。如M受体阻滞剂、蛋白质或DNA合成抑制剂、缺氧、电损毁或化学损毁海马、隔区等局部区域等。而本实验采用实验大鼠喂饲高TC饲料(1％胆固醇)，造成高TC血症，进而使Aβ生成增多，出现学习记忆能力损伤、Aβ沉积等AD的特征样改变的方法制作复合老年性痴呆的动物模型。高胆固醇致Aβ增高老年性痴呆大鼠模型目前在国外普遍使用[3，4]，该方法造模简便易行且有比较肯定的证据表明：高胆固醇能致Aβ增高产生拟衰老反应。故以喂饲高胆固醇方法复制的老年学习记忆障碍模型应是研究AD较为理想的模型之一。

大多数学者认为，AG在脑内的异常沉积是AD发病较为初始的因素，在AD发病机制中具有关键作用[5]。有关AD的发病机制，目前普遍认为是Aβ病因学说。Aβ由分泌酶水解β淀粉样前体蛋白产生。AD病人海马区APP751水平2倍高于非AD海马区的APP。APP功能和学习记忆密切相关，促进神经细胞生长分化，增加神经突触的可塑性，及参与信号传导，促进细胞黏附[6]。而细胞内胆固醇的含量对APP和Aβ代谢影响很大，在细胞内转运胆固醇(NPC)脑内，由于神经原纤维改变(AID的核心病变之一)，可能与胆固醇异常代谢有关。Aβ在脑内异常凝集分子基础可能与胆固醇参与促进可溶性AJ3的凝集的特异性。Aβ的形成依赖细胞内胆固醇，胆固醇的代谢随着年龄而改变，是AD以脑的老化为基础而发病的分子机制，胆固醇在其中起关键性作用[7]。针对Aβ纤维在AD发病中的关键作用，研究如何阻断和延迟AD早期Aβ的积聚以及如何消除已形成的Aβ斑块沉积为治疗AD提供了切入点。

因此，根据老年性痴呆的发病特征及痰瘀阻窍、肾精亏虚这一原则，采用脑灵汤益肾健脾、活血化瘀、开窍涤痰，经临床验证，该方在改善老年痴呆病人学习、记忆能力方面有显著疗效。本次实验通过测定AD大鼠血清TC及脑内Aβ、APP水平来探讨脑灵汤治疗AD的作用机制，结果显示：经该方治疗后模型大鼠学习、记忆明显改善；脑内Aβ、APP含量明显下降。该方和西药相比，在降低血清TC及脑内Aβ、APP含量方面明显优于西药舒降之组(P＜0.05)。提示腑灵汤能够降低AD大鼠血清总胆固醇水平、抑制APP的产生、减少脑组织Aβ含量从而改善大鼠的学习、记忆能力，对AD具有一定治疗作用。

参考文献：

[1] Masters CL．Simms G，Weideman NA，et al．Amyloid plaque cor-erepten in Alzheimer disease and Down’s syndrome[J]．Pme Natl A-cad Sci USA，1985，82(12)：4245―4247．

[2]　秦德，王新德．β－淀粉样蛋白及Tao和Alzheimer病关系的研究[J]．国外医学：老年医学分册，1998，19(4)：164．

[3]　Marx J．Ahheimer’s disease hadforthe heart，bad for themind[J]．Science，2001，294：508―509．

[4] Kojro E，Gimpl G，Lammich S，et al．Low cholesterol stimulates thenonamyloidogenic pathway by its effect on the alpha－secretaseADAM 10[J]．Proc Natl Acad Sci USA,2001，98：5815―5820．

[5] 金万花．铝在阿茨海默病中的作用[J]．国外医学：老年医学分册，1994，15(1)：7―8．

[6]　郑玉新，梁友信．职业性接触铝的神经毒性研究[J]．国外医学：卫生学分册，1995，22(4)：198―200．

[7] Rossner s，Ueberham u，Schliebs R，et al．The regulation of amyloid precurmr protem metabolism by chotinergic mechanisms and neu-rotrophin receptor singnaling[J]．ProgNeumbiol，1998，56(5)：541-569．

作者简介：裴异(1974―)，女，毕业于湖南中医药大学，主治医师，医学硕士，现工作于湖南省长沙市中心医院(邮编：410003)；何明大，工作于中南大学湘雅附属二医院；黄孟军，工作于广西中医学院研究生院。

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