柱前衍生法测定保健液中牛磺酸含量

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摘要：利用邻苯二甲醛(OPA)与牛磺酸定量反应生成邻苯二甲醛牛磺酸衍生物,采用高效液相色谱法分离并测定口服液中牛磺酸的含量,结果衍生化反应迅速,分离条件好,在0~50ng线性关系良好,检测限为20ng,回收率可达到90％以上,该法灵敏度高,迅速,高效。

关键词：柱前衍生法 高效液相色谱法 牛磺酸含量

牛磺酸广泛分布于动物组织细胞内,海生动物含量尤为丰富,哺乳类组织细胞内亦含有较高的牛磺酸,特别是神经、肌肉和腺体内含量更高,是机体内含量最丰富的自由氨基酸。牛磺酸也是细胞不可缺少的因子,特别是肝脏、心脏、大脑、脾脏等细胞中都特别需要牛磺酸。

牛磺酸是一种非蛋白氨基酸。牛磺酸不参与蛋白质的合成,与胱氨酸、半胱氨酸的代谢有密切关系,人体合成牛磺酸的能力很低,必须从食物中获得,是人体必需的一种氨基酸。

天然的牛磺酸在脑内的含量丰富、分布广泛,能明显促进神经系统的生长发育和细胞增殖、分化,且呈剂量依赖性,在脑神经细胞发育过程中起重要作用。如果补充不足,将会使幼儿生长发育缓慢、智力发育迟缓。牛磺酸与幼儿、胎儿的中枢神经及视网膜等的发育有密切的关。补充适量牛磺酸不仅可以提高学习记忆速度,而且还可以提高学习记忆的准确性,并且对神经系统的抗衰老也有一定作用。

牛磺酸无共轭双键,在紫外区无吸收,需经衍生后方可产生吸收从而进行含量测定[1],本法采用邻苯二甲醛(OPA)与牛磺酸定量反应生成邻苯二甲醛牛磺酸衍生物,利用其有荧光这一特性,对其进行检测,结果获得了良好的灵敏度与回收率。

1、材料与方法

1.1 检测仪器

LC20液相色谱仪、荧光检测器（日本岛津公司）,CAPELL PAK C18色谱柱（15cm×0.46 mm,5 μm）（日本资生堂）,ALC-1100 电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试剂试药

邻苯二甲醛(OPA,分析纯,国药集团化学试剂有限公司);甲醇(色谱纯,天津康科德科技有限公司);乙硫醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);乙腈(色谱纯,美国天地);0.4mol/L硼酸钠缓冲液(2.48g硼酸和1.41g氢氧化钠,加水溶解并定容至100mL);衍生化试剂(取OPA0.1g,加0.1mL乙硫醇,0.4mol/L磷酸钠缓冲液定容至100mL);牛磺酸(生化试剂)。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱:4.6mm×200mm,C18柱（5μm）;流动相:甲醇-乙腈-水(10:10:80),检测波长:330nm;流速:1.0 mL/min;进样量:20μL。

1.3.2 对照溶液

取牛磺酸0.05g,精密称定,加水溶解后移入50mL量瓶中,精密量取该溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL,分别置于50mL量瓶中,加水稀释并定容至刻度,混匀,配制成牛磺酸系列溶液(浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL)。

1.3.3 供试品溶液

精密量取某口服液0.5mL,加水稀释至100mL,吸取该溶液2.5mL,置于5mL具塞离心管中,再准确加入2.5mL衍生剂摇匀,反应2min后,经0.45μm的微孔滤膜过滤,立即进样20μL,进行HPLC分析,测定峰面积。

2、结果与讨论

2.1 线性

精密量取牛磺酸系列溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图。以牛磺酸浓度(x,μg/mL)为横坐标,以其对应的的峰面积(y)为纵坐标,绘制标准曲线。得线性方程y=4572x-12358,线性方程相关系数r=0.9999,结果表明牛磺酸在0~50μg/mL浓度范围内,线性关系良好。

2.2 精密度

取20μg/mL样品,连续进样6次,所得峰面积RSD为:0.64%,表明本方法精密度良好。

2.3 衍生物稳定性

由于牛磺酸衍生物在室温条件下不稳定,因此,样品应在5min内完成进样,且每次进样时间应保持一致,因此,本次实验控制在反应4min时进样,结果稳定性良好。

3、结论

本方法测定口服液中的牛磺酸含量快速、简便,且精密度良好,衍生化产物稳定性不高,不适合大批量样品的集中处理和进样。

参考文献

[1]李云兰,丁红,刘玉明等.柱前衍生化HPLC法测定牛磺酸软胶囊中牛磺酸的含量[J].中成药,2001,23(12):871-873.

[2]GB5413.26 2010 食品安全国家标准,婴幼儿食品和乳品中牛磺酸的测定[S].

[3]GB/T 5009.141-2003 食品中诱惑红的测定[S].