丹参糖蛋白组分的自由基清除活性研究

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摘要：目的测定丹参糖蛋白4种浓度的乙醇分级沉淀物对自由基的清除作用。方法用可见分光光度法测定。结果丹参糖蛋白的4种乙醇分级沉淀物对DPPH，・OH，O2－・自由基均有明显的清除作用，清除率可达到15.3％～86.9％，且量效关系明显。结论丹参糖蛋白是一种良好的自由基清除剂。

关键词：丹参；糖蛋白；分级沉淀；自由基清除剂

中图分类号：R972文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)08-0011-03

植物糖蛋白是继多糖之后食品功能性成分开发和研究的热点，这类成分的一些特性有益于人体健康，在生化、医药、食品等领域具有多方面的用途。丹参是我国常用中药，味苦，性微寒，具有活血去瘀、通经止痛、清热安神之功效，可用于治疗冠心病、中风、微循环障碍等疾病[1]。现代药理研究证明，丹参中脂溶性有效成分为丹参酮类，有抗菌作用[2]；水溶性有效成分为酚酸类，有改善记忆，降低抗癌药阿霉素毒性等作用[3]。目前对丹参的研究仅限于以上所述小分子活性物质，国内外对于丹参多糖及其复合物的研究尚未见报道。本研究以丹参糖蛋白粗品为原料，用乙醇分级沉淀得到不同的糖蛋白组分，测定各组分对1-1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）、羟自由基（・OH）和超氧阴离子自由基（O2－・）的清除作用，评价各组分的抗氧化活性，为开发丹参新的活性成分奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料丹参糖蛋白粗品，本课题组从中药丹参中分离得到。

1.1.2仪器UNIC2000型紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；HHW-21CU-600型电热恒温水槽、DGX-9073B-1型电热鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.1.3试剂无水乙醇，过氧化氢，硫酸亚铁，水杨酸，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，1-1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH，C18H12N5O6），均为分析纯；还原型辅酶I-吩嗪硫酸甲酯-氮蓝四唑（NADH-PMS-NBT）。

1.2方法

1.2.1丹参糖蛋白粗品的乙醇分级沉淀称取一定量丹参糖蛋白粗品，加水充分溶解得糖蛋白溶液。向此溶液加入无水乙醇搅拌至醇浓度为20%，密封置冰箱15 h；3 000 r/min离心45 min，得沉淀组分a，真空干燥，称重；向上步离心得到的上清液加入无水乙醇至醇浓度为40 %，离心得2次沉淀物b，干燥称重；再向第2次离心后的上清液加入无水乙醇至醇浓度为60 %，离心得3次沉淀物c，干燥，称重；变乙醇浓度为80%，离心分离得4次沉淀物d，干燥，称重。

1.2.2丹参糖蛋白的不同组分对DPPH的清除作用[4]将丹参糖蛋白的不同组分分别配制成500，700，900，1 100μg/mL 的水溶液；以无水乙醇为溶剂配制0.177 7 mmol/L的DPPH溶液。依次向10 mL比色管加入4 mL pH 6.88的磷酸盐缓冲溶液，4 mL DPPH溶液，混匀，再加入1 mL丹参糖蛋白溶液，蒸馏水补至刻度，充分混匀，10 min后在520 nm处测定吸光度。按下式计算DPPH的清除率：

A0：不加样品液DPPH溶液的吸光度；As：加入样品溶液反应后DPPH溶液的吸光度；AX：不加DPPH溶液加样品的吸光度

1.2.3丹参糖蛋白不同组分对・OH自由基的清除作用[5]不同组分的丹参糖蛋白配制成50，100，200μg/mL的水溶液。依次向10 mL 试管加入6 mmol/L的FeSO4 溶液 2 mL ，丹参糖蛋白水溶液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，摇匀，静置10 min。再加入6 mmol/L的水杨酸溶液2 mL，摇匀，静置30 min后于510 nm处测定吸光度。按下式计算・OH的清除率：

A0：不加样品液溶液的吸光度；As：加入样品溶液反应后的OH吸光度；AX：不加水杨酸溶液时丹参糖蛋白的吸光度

1.2.4丹参糖蛋白不同组分对O2的清除作用[6] 不同组分的丹参糖蛋白配制成50，100，200，400μg/mL的水溶液；O2－・由NADH-PMS-NBT系统（16 mmol/L，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，内含NADH 73 mmol/L，PMS 15 mmol/L，NBT 50 mmol/L）产生。依次向10 mL 的试管加入丹参糖蛋白溶液1 mL，再加NADH-PMS-NBT系统（空白管不加PMS，对照管不加丹参糖蛋白溶液），总体积为3 mL，静置10 min测吸光度。按下式计算 O2的清除率：

A0：不加样品液溶液的吸光度（对照管）；As：加入样品溶液反应后O2－・的吸光度；AX：不加PMS溶液时丹参糖蛋白的吸光度（空白管）。

2结果与分析

2.1丹参糖蛋白的不同组分清除DPPH的作用

结果见表1。

由表1和表2可见，丹参糖蛋白的不同组分对DPPH自由基均有明显的抑制作用，且有剂量与效应关系，随着反应体系中丹参糖蛋白浓度的增加，对自由基的抑制作用明显增加，最大抑制率达到86.9 %；比较同浓度不同组分的丹参糖蛋白，40 %乙醇沉淀的糖蛋白对自由基的抑制率最高，80 %与20 %组相近，60 %组的抑制率最低。

2.2丹参糖蛋白不同组分清除・OH的作用

我们采用FeSO4+H2O2产生・OH，向反应体系加入水杨酸以产生有色产物2,3 -二羟基苯甲酸的方法，测定丹参糖蛋白对・OH的抑制作用。见表3、表4。

由表3和表4可见，丹参糖蛋白对・OH自由基有明显的抑制作用，且有明显的剂量与效应关系，随着反应体系中丹参糖蛋白浓度的增加，对自由基的抑制率最大可达79.5%；比较同浓度不同组分糖蛋白， 20%组对自由基的抑制率显著高于其他组，80%组与 40%组近似，60%组显著低于其他组。

2.3丹参糖蛋白不同组分清除O2－・的作用

由表5与表6可以见，丹参糖蛋白对O2－・自由基有明显的抑制作用， 有剂量与效应关系，抑制率最大可达81.2%；比较同浓度不同组分糖蛋白，20%乙醇沉淀的糖蛋白对自由基的抑制率显著高于其他组；80%组与40%组近似，60%组显著低于其他组。

以上结果表明，丹参糖蛋白对不同种类的自由基均有明显的清除作用，清除率为15.3 %～86.9%。在相同条件下，丹参糖蛋白对自由基的清除率与浓度呈正相关。提示丹参除了作为常用的治疗冠心病、中风、微循环障碍等疾病的药物外，还可用作抗氧化剂，清除及防止人体内氧自由基的危害。丹参糖蛋白有可能成为一种新型的食品添加剂。

参考文献

[1]黄双盛，吴勇杰. 丹参的抗氧化与抗炎作用研究进展[J]. 中国中医药信息杂志，2002，1（9）：86-87.

[2]徐任生. 丹参生物学及其应用[M]. 北京：科学出版社，1990：81.

[3]杜冠华，张均田. 丹酚酸A对小鼠脑缺血再灌注致学习记忆功能障碍的改善作用及作用机制[J]. 药学学报，1995，30（3）：184-190.

[4]郭亚力，李 聪，欧灵澄，等. 槐米中天然抗氧化剂的提取及其抗自由基性能研究[J]. 食品科学，2004，25（7）：154-157.

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[6]田京伟，杨建雄. 白藜芦醇苷的体外抗氧化活性[J]. 中草药，2001，32（10）：918-920.

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