盐胁迫对离体百合不定芽诱导及生理活性的影响

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摘要： 采用组织培养法研究了5种NaCl浓度0%，0.3%，0.5%，0.8%，1.2%对百合不定芽诱导、生长及丙二醛（MDA）、脯氨酸、蛋白质含量和过氧化物酶活性的影响。结果表明：百合对盐胁迫极为敏感，随NaCl浓度的增加，百合不定芽形成频率逐渐降低，不定芽及不定根生长缓慢，且在1.2% NaCl浓度下，无不定芽及根的形成。进一步的生理活性检测结果表明，百合不定芽的丙二醛、脯氨酸含量均随NaCl浓度的升高而增加,并在0.8% NaCl浓度下达到最高，分别为201.23 μmol/g和225.7 μg/g；蛋白质含量呈先降后增的趋势，在0.3% NaCl浓度下最低为0.96 mg/g；POD活性也随NaCl浓度的升高而增加，于0.8%浓度下达到最高，为181.60 U/(min•g）。综合盐胁迫对百合不定芽生长及生理活性的影响，0.8% NaCl浓度为百合外植体、不定芽忍耐盐胁迫的阈值。

关键词： 百合;盐胁迫;不定芽；生理活性

中图分类号： S 644.1文献标识码： A

文章编号： 1009-5500(2011)03-0040-05

百合属(Lilium)植物约100种[1],按其用途可分为观赏百合、药用百合和食用百合。在我国用于食用的有甘肃兰州百合、湖南龙牙百合、江苏宜兴百合和河南洛阳百合,其中以兰州百合品质最好[2],其鳞茎硕大,鳞片饱满洁白,品质细腻,营养丰富,香味浓郁,因有很高的食用价值而享誉全国。有关兰州百合的研究报道中，主要涉及到组织培养、种植技术、食用营养、生理及病害的研究，尤其是兰州百合组织培养技术已趋向成熟,为工厂化育苗提供了可靠的技术参数。由于，百合生产中广泛存在不合理灌溉及耕种,使盐渍化耕地的面积日益扩大；而百合最适宜在排水良好的微酸性环境中生长，对盐碱较为敏感；故生长于盐渍土壤环境的百合不仅产量、品质下降，而且年年的连作更加剧了病害的发生。目前，盐胁迫对众多植物的伤害机理已有很多报道[3，4]，但对兰州百合生长及生理状态的影响较少报道。因此,通过设置不同NaCl浓度研究兰州百合对盐胁迫的反应,旨在为今后筛选兰州百合耐盐品系奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

兰州百合(L.davidii var.unicolour)鳞茎。

1.2 实验方法

1.2.1 百合不定芽的诱导 将兰州百合鳞茎流水冲洗30 min，剥去外部鳞片后，用20%的84消毒液消毒10 min，无菌水冲洗3～5次，每次3 min；于超净工作台上将鳞片外植体剪至长×宽为0.5 cm×0.5 cm，接入含有不同外源激素的不定芽诱导培养基中,并置于2 000 lx不间断光照下培养。培养15 d后记录不定芽增殖率，筛选最佳不定芽诱导培养基。

不定芽诱导率=（产生不定芽的外植体数/接入的总外植体数）×100%；

不定芽诱导培养基：

①MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L BAP

②MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L BAP

③MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L BAP

④MS+2.0 mg/L NAA+2.0 mg/L BAP

⑤MS+0.2 mg/L NAA+3.0 mg/L BAP

1.2.2 盐胁迫对兰州百合不定芽的影响 以1.2.1方法处理兰州百合外植体，接种于含有不同NaCl浓度的②号培养基中，NaCl浓度分别为0%、0.3%、0.5%、0.8%、1.2%；每一浓度水平接种10瓶。接种45 d，观察统计各NaCl浓度下百合不定芽的诱导频率。测定不定芽的株高、根长以及相关的生理活性指标。

1.3 相关指标测定

不定芽株高、根长采用直尺测量，精确到毫米。参照文献[5]的方法测定丙二醛、脯氨酸含量；参照文献[6]的方法测定蛋白质含量；参照文献[7]的方法测定POD活性，以每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活单位。

2 结果与分析

2.1 不同外源激素对百合鳞片外植体不定芽诱导频率的影响

将兰州百合鳞茎外植体小块接入培养基中进行不定芽诱导，①号、②号培养基中的外植体小块接入10 d出现绿色芽点，③④⑤号培养基中芽点出现略迟（约15 d）。5种不同激素配比的培养基诱导的不定芽频率明显不同（表1），以②0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L BAP的激素配比获得的百合不定芽频率最高，为63.5%，且幼苗的生长状态最好（图1）；次之为①0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L BAP组合，不定芽的发生频率可达52.2%。随着NAA、BAP浓度的增加，百合鳞茎不定芽的发生频率反而有下降的趋势（表1、图1）。故试验选择②号培养基MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L BAP为诱导不定芽的最适培养基，并以此培养基作为探讨不同NaCl浓度胁迫下百合不定芽诱导、生长及生理活性变化的基本培养基。

2.2 盐胁迫对百合不定芽诱导频率的影响

NaCl浓度对百合不定芽的形成及诱导频率具有显著的影响（表2）。在MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L BAP不定芽诱导培养基中，不加NaCl获得的不定芽频率最高，为77.0%；当培养基加入0.3%NaCl时，不定芽诱导频率比对照降低25.97%；NaCl浓度为0.8%时，不定芽诱导频率急剧下降，仅为8.1%；当盐浓度达到1.2%时，接入的百合鳞茎外植体小块全部褐化死亡。结果说明，兰州百合不定芽对盐胁迫极为敏感，当NaCl浓度＜0.8%时，尚能诱导出一定量的不定芽（图2），当超过0.8%时，大部分外植体死亡，故推测0.8% NaCl浓度是兰州百合外植体忍耐盐胁迫的阈值。

2.3 盐胁迫对百合不定芽高度及根长的影响

NaCl浓度对百合不定芽高度及根长同样具有极显著的影响（图2，3，4）。0.3%NaCl浓度下，百合外植体所形成的不定芽高度与对照无差异，且能产生正常的根，但根的长度与对照相比明显短，仅为0.61 cm。随着NaCl浓度的继续升高，不再有根的产生。当NaCl浓度为0.5%和0.8%时，不定芽高度比对照分别降低70.89%和92.29%。表明高浓度盐将抑制不定芽的生长及根的形成。

2.4 盐胁迫对百合不定芽生理活性的影响

2.4.1 盐胁迫对百合不定芽丙二醛含量的影响 植物遭受逆境胁迫时，首先影响的是细胞膜透性，MDA是膜质过氧化的产物，是细胞膜受损伤程度的标志。当百合不定芽未受盐胁迫时，MDA含量仅为50.02 μmol/g;随NaCl浓度的升高，MDA含量逐渐升高，并在0.8 % NaCl浓度下达到高峰，为201.23 μmol/g，比对照提高了302.29%(图5)；可见高盐胁迫下百合不定芽细胞膜明显受到伤害。

2.4.2 盐胁迫对百合不定芽脯氨酸含量的影响 脯氨酸是渗透胁迫下易于积累的一种氨基酸，能在植物遭受逆境胁迫时起渗透调节作用。随着NaCl浓度的升高，脯氨酸含量急剧上升，并在0.8% NaCl浓度下达到峰值，为225.7 μg/g(图6)。比较各盐浓度下脯氨酸含量与对照的差异，发现0.3%，0.5%和0.8%的NaCl浓度下的脯氨酸含量分别比对照高105.24%，241.02%和454.87%。

2.4.3 盐胁迫对百合不定芽蛋白质含量的影响 随着NaCl浓度的升高，百合不定芽可溶性蛋白质含量呈先降后增的趋势，当NaCl浓度为0.3%时，可溶性蛋白质含量明显低于对照，仅为0.96 mg/g;当NaCl浓度为0.5%、0.8%时，可溶性蛋白含量急剧上升，分别为1.74和4.06 mg/g，尤其是0.8%盐浓度下的蛋白质含量极显著的高于对照(图7)。

2.4.4 盐胁迫对百合不定芽POD活性的影响 供试范围内的NaCl浓度能显著影响百合不定芽的POD活性。未加NaCl（对照）的②号培养基中形成的不定芽，其POD活性很低，仅为4.01 U/(min•g);当NaCl浓度为0.3%、0.5%时，不定芽的POD活性显著高于对照，变动为34.70、37.60 U/(min•g)；当NaCl为0.8%时，POD活性达到最高，为181.60 U/(min•g)，是对照的45倍(图8)。

3 讨论

盐分对非盐生植物最普遍和最显著的效应是抑制其生长[7]。在此次试验中，同样表现出NaCl胁迫下百合不定芽频率的降低及生长速度的变慢；尤其当NaCl达到0.5%时，虽然百合外植体可以产生少量不定芽，但生长极为缓慢，且不生根，而1.2%的盐浓度完全抑制了百合不定芽的形成。

脯氨酸在渗透调节方面的作用：(1)作为细胞质的渗透调节物质,(2)作为防脱水剂。脯氨酸是无毒的中性溶质,也是水溶性最大的一种氨基酸，在一定的盐胁迫范围内,许多植物是通过渗透调节作用来维持细胞的一定含水量和膨压,从而维持细胞的正常功能。在此次试验中，脯氨酸含量随盐浓度的增高而积累，前期可能是百合不定芽对盐胁迫的一种适应，但后期则可能由于受伤害的细胞代谢紊乱，抑制脯氨酸参与蛋白质合成，从而产生大量游离氨基酸。

此外，盐胁迫对植物的伤害也与活性氧自由基所引发的过氧化作用有关。在正常生长环境下,植物细胞内活性氧自由基的产生与清除处于动态平衡状态,但当植物受到环境胁迫时,这种平衡就会破坏,致使活性氧自由基大量积累,对植物造成伤害[8]，导致蛋白质发生降解及膜脂过氧化的自由基链式反应[9],使质膜受到严重伤害[10，11]，而脂质过氧化物会继续分解形成低级氧化产物MDA，故MDA含量的多少可作为细胞膜受损伤程度的指标；试验中0.3%的NaCl浓度下不定芽的MDA含量并不很高，百合膜系统并未受到严重伤害，故不定芽的生长及根的生长基本正常；但当盐浓度增大，尤其在0.8% NaCl浓度下，其含量高达201.23 μmol/g，百合不定芽的生长几乎停滞，这可能是膜系统受到伤害的结果。

植物体内的抗氧化酶能够清除体内多余的活性氧自由基,维持自由基的代谢平衡,保护植物免受伤害，实验中抗氧化酶POD活性随着盐浓度的增加而提高，或许正是避免或减轻植物受到盐伤害的一种表现。

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Effect of salt stress on adventitious bud induction and its physiological activity of lily

LIU Wei-wei1，WANG Bin-zhong1，HAO Li-mei1，HUANG Hui-yingD2

(1. College of Life Sciences and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou,730070,China; 2. College of Agronomy,Gansu Agricultural University,Lanzhou,730070,China)

Abstract: The experiment study the effect of different NaCl concentration(0,0.3%,0.5%,0.8%，1.2%)on the adventitious bud induction,growth and its content of MDA,Pro,protein and activity of POD.The results showed that lily was very sensitive to salt stress.The formation frequency of adventitious bud was low and the growth of adventitious bud and root were slow with increase of NaCl concentration.There were no adventitious bud and root at NaCl concentration of 1.2%.Moreover,the result of physiological activity test showed that the content of MDA and Pro were increase by the increase of salt concentration and finally reached the highest content(201.23 μmol/g and 225.7 μg/g)at the salt concentration of 0.8%,The content of protein decreased to the bottom of 0.96 mg/g at 0.3% NaCl.The activity of POD reached the highest point of 181.60U/min•g at the salt concentration of 0.8%.The Nacl concentration of 0.8% was the salt stress threshold value to explants and adventitious bud of lily.

Key words： salt stress；adventitious bud；lily；physiological activity

注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”