浅谈原料乳主要微生物检验技术和关键要点
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摘要：目前，国家对食品安全监管的程度是前所未有的严格，为了企业的产品质量同时也是对社会消费者负责任的态度，不但加大了抽检的密度，同时也对每一类食品增加了不少的检验项目，我们作为食品质量检验的人员，也前所未有的感到责任之重大和压力，但想到我们的工作是为食品的安全性有了更好的保障而提供依据，就感觉到再苦再累也是光荣的和有重要意义的，那么提高检验员的检验技术也是非常有必要的，本文主要是论述了原料乳微生物检测技术-菌落总数的检测和该检测技术操作方面的关键要点（细节) ，这里就我个人的工作体会与看法，提出来与大家相互交流和探讨，希望能共同学习吧。
关键词：原料乳微生物菌落总数菌落无菌操作空白对照
原料乳（又叫生乳）是指从正常饲养的健康母牛体上挤出的乳汁。它是乳制品的原料，含有蛋白质、脂肪、乳糖、维生素、矿物质等等，由于原料乳营养丰富，所以它同时又是微生物最好的天然培养基，微生物是一群肉眼看不见或看不清、手摸不着的、必须借助生物显微镜才能看得到的微小生物。刚挤下的乳所含的微生物是不多的，每毫升大约几个到几千个之间，但随时间的增加、管理不当和环境变化等不良因素影响，挤下来的乳很容易受到微生物的污染，受污染的乳引起微生物大量繁殖，鲜乳就会酸度增高或酸败等严重影响奶的质量，严重酸败的原料乳是不得用作加工乳制品的原料的，可见要生产出高质量的乳制品，必须从原料乳的质量抓起。由于原料乳微生物中主要是一些无害的细菌多，所以GB19301-2010《生乳》规定微生物的检验就是“菌落总数”这一项目。菌落总数是指食品检验经过处理，在一定条件下（如培养基成分、培养温度、培养时间等）培养后，所得每克或每毫升检样中形成的微生物菌落总数。菌落是由单个细菌（或其他微生物）细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见有一定形态结构等特征的子细胞的群落。在固体培养基上（内）以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞的集团。在GB19301-2010《生乳》中规定了微生物的限量值≤200万CFU/mL，但比2003版的国标值≤100万CFU/mL，放宽了一倍，放宽了好象让人有点费解，国家定出这样的标准不知道是出于什么原因了。虽然如此，并不是说明对检验就比以前也放松了，反而从2008年的三聚氰胺事件后，直到现在，国家是严管严控乳制品的，单是生乳已增加了不少的检验项目，有三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、农残、兽残、重金属等，同时也加大了抽检密度。要生产出优质的乳制品，首先要从乳制品的源头-原料乳抓起，没有好的原料乳，就无法生产出高品质的乳品，这说明国家对社会和消费者是负责任的。原料乳中菌数总数能反映原料乳受微生物污染的程度，作为原料乳卫生评价的重要指标之一，应严格按GB 4789.2-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中规定的方法进行检验，且必须要严格执行无菌操作，微生物的无菌操作是指在无菌环境下进行的细胞传代培养、细菌接种等操作，或用于防止微生物进入人体或其它无菌范围的操作技术。食品检验员必须经培训和验证专业操作技能合格后，才能上岗做检测工作。
实验前的准备：所有用于微生物检验的仪器、用具，培养基等物必须经过灭菌处理，保持无菌可用状态，在进入无菌室或超净工作室前，先把菌落总数检验所需的已灭菌好的物品，经传递窗口传入已经消毒的无菌室或超净工作室备用，经灭菌过且已溶化的平板计数琼脂培养基置于46-50℃的恒温水浴锅中保温待用。做好样品的编号，并记录在微生物的原始记录中，先在一无菌的培养皿内注入15mL平板计数琼脂培养基，并暴露至整个接种过程结束，盖上平板盖，并标记好作为环境对照。
检验步骤：
①样品的前处理：先把样品充分摇匀，以无菌手续去掉瓶盖，瓶口用火焰消毒，用10mL的灭菌吸管移取25mL奶样，置于装有225mL灭菌生理盐水（浓度为0.85％）的三角烧瓶内，充分混合均匀，制成10倍的样品均液备用。
②样品的递增稀释：用1mL无菌吸管吸取10倍的样品均液1mL，沿着管壁缓慢注入装有9mL稀释洗液的无菌试管中，充分摇匀或换用1支灭菌吸管反复吹打均匀，让样品混合均匀，做成100倍的样品稀释液。用以上同样的方法，制备一系列的样品稀释均液，根据污染程度的估计，生乳一般稀释到1000倍至10万倍，每次递增稀释时必须换用1支1mL无菌吸管，并在试管壁外面标记好相应的稀释度，以防在操作过程中弄错稀释度，若弄错了稀释度整个样品的检验结果就会出现严重失实，造成结果误判，以至误导了各方的管理和伤害了相关的利益，所以这点尤其重要，特别是新手，所以国家要求检验员必须先经培训，并通过考核验证合格后才能上岗的重要性了。
在操作以上一、二（即是吸取样品液和做样品递增稀释操作时），应注意吸管或吸管口尖端不要触及稀释液面，由于生乳中含有的细菌比较多，若接触到液面会使稀释中的细菌浓度增多，稍有偏差的量，均会影响结果，而且差别会特别大，可能是几十倍或上百倍的差异，最终导致结果误差大。按要求准确吸取样液的操作，是得到准确可靠结果的重要技术之一，在操作过程中若发现有移液管口尖端有破损的，是不能用来吸取原料乳的样液和稀释液，若这样会使稀释液中的细菌数浓度变小了，最终使结果相差甚远和失实，整个检验就没达到检验的目的和失去了检验的意义。
③样品的接种：依样品污染程度的估算，生乳一般选择2-3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释的同时，用无菌操作吸取1mL样品匀液于无菌平皿（即是培养皿）内，每个稀释度接种两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个灭菌的平皿内作空白对照。并及时将冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（一般为手感不烫手为准）约18mL倒入注有稀释液的平皿，然后轻轻转动平板，待凝固后翻转平板，并保持写有样品编号和培养基的一面朝上。注意所做样品不要超过20分钟，就必须倒入培养基，若不及时倒入培养基就有可能引起片状菌落生长或菌落蔓延等不利于细菌生长的不良现象。
④样品的培养：将所有好凝固后的培养皿，包括空白和环境对照的，全部置于35-37℃的恒温培养箱中保持培养48小时。
平板经37℃48小时培养后，拿出所有培养皿，计算菌落总数的数目，并记录在相应的稀释度上，菌落计数以菌落形成单位CFU表示。在计数过程中，根据菌落生长状况的不同（如菌落的数目大小或是否有片状菌落生长等），本文就不再一一详述具体情况了，请参照GB 4789.2-2010 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中规定的原则和方法来计数菌落和报告检验结果。
由以上的检验过程可以看出，微生物检验自始至终，必须要严格执行无菌操作，无菌操作是微生物检测中的重要环节，整个微生物检验过程中的培养基、检测设备等都要处于无菌前提下，样品才可能不受污染，才能实现微生物检验的准确、可靠，检验员要有良好的思想情操和严谨的工作态度，操作过程精神要集中，按标准规定准确吸取充分摇均匀的样品和样液（这点新手操作时特别注意），由于生乳中含有的细菌比较多，稍有偏差的量，均会影响结果，而且差别会特别大，可能是几十倍或上百倍的差异，准确吸取样液，在操作过程中若发现有移液管口尖端有破损的，是不能用来吸取原料乳的样液和稀释液的，否则也会使最终结果相差甚远，所以我们必须熟练掌握好原料乳微生物的检测技术，注意操作过程中的细节，因目前很多企业与奶户是按细菌总数多少，进行定生乳等级而计价的，所以为奶户和公司的利益做好我们的检验工作，也为社会广大的消费者负责，为生产出高质量的乳制品，而做好原料乳质量把关的工作，平时注意为提高个人的检测技术多学习。
参考文献：
[1]GB 4789.2-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数的检测》.
[2]任静，张兰威，宋兴舜.原料乳高产脂肪酶嗜冷菌株的鉴定[A].Proceedings of 2010 First International Conference on Cellular,Molecular Biology,Biophysics and Bioengineering(Volume 4)[C].2010.
[3]任静，张兰威，王芳.原料乳中嗜冷菌计数及产脂肪酶特性的研究[J].食品科学，2006(05).