乳杆菌发酵生产工艺研究
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重组干酪乳杆菌是一种活载体口服疫苗候选菌株，并兼有乳酸菌的益生功能，而且在体内能够发挥许多生理效应。传统的干酪乳杆菌放大培养用MRS培养基进行，细菌数量和表达量较高，但MRS培养基的价格比较贵，成本较高，口感欠佳，所以人们将目光放在价格低廉，营养丰富，口感香甜的乳清蛋白上。乳清蛋白是从巴氏杀菌的乳清中去除非蛋白并经过过滤沉淀制成的。乳清蛋白口感好，营养丰富，易消化吸收。将二者的优势结合起来以求研制出兼具预防和营养功能畜用口服液制剂。研究旨在将二者优势结合起来以求研制出一种兼具预防和营养功能的畜用口服液制剂。试验选用乳清浓缩蛋白80为原料，研究其生产工艺最佳参数，制备有利于重组菌存活的液体制剂，为进一步制备预防仔猪腹泻口服液疫苗奠定基础。
1材料
1.1质粒和菌株TGEV-BC重组干酪乳杆菌有试验构建并保存；干酪乳杆菌CICC6105（LactobacilluscaseiCICC6106）购自中国工业微生物菌种保藏中心。
1.2主要试剂琼脂糖购买自Spanish公司产品；氯霉素购自Sigma公司；YeastExtract购自OXOID公司；其他生化试剂为国产分析纯产品。
2方法
2.1口服液疫苗生产工艺流程菌种活化菌种鉴定转接入乳清蛋白培养基生产工艺参数优化
2.2重组菌的活化挑取培养好的MRS琼脂平板上的单菌落，接入10mLMRS液体培养基中，37℃静止培养16h，然后按2%接种量接入100mL的MRS液体培养基中进行扩大培养，37℃静止培养16h，备用。
2.3TGEV-BC重组干酪乳杆菌PCR的鉴定随机挑取MRS培养基上生长的单菌落，接种于含氯霉素（34μg•mL-1）的MRS液体培养基中，37℃静止培养过夜。按照DanielJ等提供的方法提取质粒，方法如下：（1）取过夜培养的菌液2mL于离心管中，12000rpm离心1min收集菌体沉淀；（2）加入含有25%蔗糖和30mg•mL-1溶菌酶的溶液200μL重悬沉淀，混合均匀后，37℃水浴20min；（3）向溶液中加入含3%SDS和0.2N的NaOH的裂解液400μL，迅速混合均匀，室温放置7min；（4）在向其中加入预冷的3M醋酸钠300μL，4℃、12000rpm离心15min；（5）将上清液移到一个新的离心管中，加入650μL的异丙醇后，4℃、12000r•min-1离心15min；（6）弃去上清，加入1mL75%的乙醇洗涤沉淀，4℃、12000rpm离心5min，重复洗涤两次；（7）倾倒上清，向其中加入30μL的含有Rnase酶的TE悬浮沉淀，-20℃保存备用。用提取好的质粒作为PCR模板进行PCR鉴定，同时设置空菌作为对照组。用1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
2.4.1乳清蛋白浓度对活菌数的影响将活化好的重组菌菌株，按2%的接种量分别接种于浓度为2%、4%、6%、8%、10%、12%和14%的150mL乳清蛋白培养基中（起始pH7.0），厌氧条件下37℃静止培养16h后分别取样，涂平板计数。
2.4.2重组干酪乳杆菌发酵时间对活菌数的影响将重组菌TGEV-BC/L.casei过夜培养，次日按2%接种于MRS液体培养基中继续培养，每2小时取样一次，测其OD值，绘制乳酸菌的生长曲线。
2.4.3培养方式对重组菌活菌数影响的结果将活化好的菌株，采用间接接种方式按2%接种量分别接种于150mL浓度为2%的乳清蛋白培养基中（pH6.6）。因为乳酸菌是厌氧微好氧菌，所以采用以下4种培养方式进行实验，即静置培养、80r•min-1振荡培养、100r•min-1振荡培养、120r•min-1振荡培养，厌氧条件下37℃培养16h后分别取样，涂平板计数。
2.4.4半连续高密度探索采用培养至对数后期的培养液进行补充新鲜培养基的方式，换液后培养1.5～2.0h，重复进行3次操作，每次测定活菌数。
2.4.52L摇瓶放大培养采用优化工艺参数，用2L摇瓶放大培养，培养结束后取样，检测基因工程重组菌的表达情况并计算活菌数。
3结果
3.1TGEV-BC重组干酪乳杆菌PCR的鉴定的结果以TGEV-BC重组干酪乳杆菌为模板，通过设计的特异性引物进行PCR扩展，扩展产物经1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，可见1349bp的特异性条带，与预期DN段大小一致。
3.2乳清蛋白浓度对重组菌活菌数的影响浓度分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%乳清蛋白培养基对重组菌活菌数的影响见图1，从图中可知，随着乳清蛋白浓度的增加，重组菌的活菌数也在随之增加，但当乳清蛋白浓度达到10%时，活菌数的数量达到最高。而后再进一步提高乳清蛋白浓度，活菌数的数量不但没有升高，反而呈现下降趋势，这说明过高的浓度并不利于重组菌的生长。因此，确定乳清蛋白的最佳浓度为10%。
3.3重组干酪乳杆菌发酵时间对活菌数的影响如图3所示，酸菌延至期细菌代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP以及其他细胞成分。细胞往往不生长繁殖，其数目无明显增加。为后面做准备；乳酸菌进入对数生长数期，细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，开始迅速繁殖，进入稳定期后，有害代谢产物积累，新增细胞数目与死亡细胞数目达到动态平衡，次级代谢产物大量积累，形成芽孢，细菌种内斗争最激烈，繁殖速率逐渐下降；进入衰亡期，细菌数目急剧下降，出现畸形细菌，营养耗尽，大量死亡。因此乳酸菌的最佳发酵时间为稳定期的中后期，所以发酵时间为16h。
3.4培养方式对重组菌活菌数影响的结果随着摇床转速的增加，当摇床转速80r•min-1时，培养基中重组菌活菌数最高。当摇床转速为120r•min-1时，培养基中重组菌活菌数略有下降低，氧气的增加对重组菌的生长有抑制作用。因此，最佳的培养方式为采用80r•min-1震荡培养，见图4。
3.5半连续培养结果如图5所示，乳酸菌发酵过程中，乳酸等次级代谢产物大量积累，抑制乳酸菌的增值，补料后实现连续带放、既可补充营养物质又调节pH，使得发酵指数得以大幅度提高，与普通发酵相比，活菌数提高了一个数量级。
3.6摇瓶培养的活菌数和基因表达结果采用优化后的生产工艺参数，即乳清蛋白培养基的浓度为4%、发酵时间16h、转速80r•min-1震荡培养、半连续培养，进行3次重复实验得到重组菌活菌数的平均实测值为7.3×109cfu•mL-1。
4讨论
基因工程菌是利用基因工程技术，将外源目的基因导入宿主细胞使其表达所需蛋白的重组菌。基因工程菌发酵是为了获得大量的外源基因表达产物，与发酵生产工艺的控制有非常重要的关系。实验利用廉价乳清浓缩蛋白对TGEV-BC重组干酪乳杆菌口服液的生产工艺进行研究，通过单因素试验，研究了乳清蛋白浓度、乳酸菌发酵时间、培养方式以及半连续培养对基因工程重组菌生长的影响。
基因工程菌的发酵是为了达到高密度培养，高密度培养需要高浓度的营养物质，才能保证菌体快速生长及大量表达目标蛋白。但过高的浓度反而会抑制菌体生长和目标蛋白的表达。在实验中，随着乳清蛋白浓度的提高，重组干酪乳杆菌活菌数逐渐升高，在乳清蛋白浓度为10%的时候活菌数达到最高。当乳清蛋白浓度超过这一范围时，菌体的生长受到了抑制，数量开始下降，因此乳清蛋白浓度选择10%为最佳培养浓度。乳酸菌发酵时间的控制是影响活菌数变化的重要因素。稳定期时有害代谢产物积累，新增细胞数目与死亡细胞数目达到动态平衡，次级代谢产物大量积累，形成芽孢，细菌种内斗争最激烈，活菌数达到最大值，稳定期是以生产菌体为目的的发酵生产的最佳收获期。因此最佳发酵时间为16h，此时活菌数最高。采用高密度发酵的工程菌，其溶氧浓度的高低也会影响培养基中的氧化还原电势，从而使菌体的代谢途径发生改变，影响菌体生长，进而影响外源蛋白表达的产量。通过搅拌、震荡方式可以控制溶解氧的浓度。在实验中，摇床转速选择为80r•min-1有利于菌体生长。
乳酸菌发酵过程中，不断地消耗营养物质，并产生大量乳酸，影响乳酸菌的生长；补料后，即可保证营养物质的供应，又可缓解pH值下降，促进乳酸菌的生长，提高活菌数。在基因工程菌的发酵过程中，要实现高密度培养及高目标产物浓度还需要对工程菌发酵关键技术进行不断地研究与改进，只有科学系统地运用发酵控制手段，才能实现目标产物的规模化和产业化生产，更好地满足市场需求。
作者：徐超 高寒 苏小明 刘伟 刘卫贞 余丽芸 单位：黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院