响应面法优化超声辅助提取果梅果实有机酸工艺
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摘要：以果梅果实为原料，利用响应面法确定其有机酸的超声辅助提取最佳工艺条件。在单因素试验基础上，以超声温度、超声时间、料液比、超声频率为自变量，有机酸提取量为响应值，使用中心组合（Box-Behnken）试验设计对各个因素的显著性和交互作用进行分析。结果表明，果梅果实有机酸的最佳提取工艺为超声温度36℃、超声时间30min、料液比1：19（mL/g）、超声功率59kHz、提取次数2次。在此条件下有机酸提取量的预测值为6.40%，实测值为6.24%，两者较接近。表明BoxBehnken试验设计和响应面法可以优化果梅果实有机酸的超声辅助提取工艺。
果梅（Prunus mume Sieb.et Zucc），俗称酸梅或青梅，原产于中国，为蔷薇科李属多年生落叶乔木，果实富含多种营养保健成分，是一种药食兼用型水果，其中最主要的营养成分为天然优质有机酸，如柠檬酸、苹果酸、儿茶酸、酒石酸、琥珀酸、丙酮酸等。有机酸在人体代谢中具抑菌、抗病毒、增加冠脉流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成、抗突变等生理功能，且具有良好的保健和药用价值。因此，进一步开发利用果梅果实有机酸并对其提取工艺进行优化具有重要意义。近年来，以青梅汁为原料的饮料深受消费者喜爱，从果实中分离、提取、浓缩出有机酸成分，加工成天然梅汁和调味品已成为国内外消费者需求的新动向。
目前，超声提取已广泛地应用于天然产物的提取，超声辅助提取具有高效、节能、省时的特点。利用超声产生的热效应、机械作用和空化效应造成植物细胞壁破裂，加快胞内含物的释放、扩散和溶解，大大缩短了提取时间，提高了提取效率。因此，合理优化超声提取果梅果实中的有机酸含量，不仅可以最大化提取有机酸含量而且还提高了果梅的利用价值。但是目前，有机酸的提取工艺普遍采用传统的提取方法，时间较长、温度较高，限制了有机酸的开发利用。因此，本研究采用响应面法对超声辅助提取果梅果实中的有机酸工艺条件进行研究，以期为进一步开发利用果梅有机酸提供试验依据。
1.材料与方法
1.1材料
果梅，采自茂兰国家级自然保护区内的洞塘乡：氢氧化钠、酚酞（1%）、邻苯二甲酸氢钾均为分析纯。
SK8210LHC型超声波清洗仪，上海科导超声仪器有限公司；JJ-2型组织捣碎匀浆机、HH-2型数显恒温水浴锅，金坛市荣华仪器制造有限公司：CPl53型电子天平，美国奥豪斯公司：ThermoD-37520型高速冷冻离心机，德国Heraeus公司：Milli-Q型超纯水系列，美国密理博公司。
1.2方法
1.2.1样品制备 在同一地点选择树龄相同、长势一致的果梅树5棵，取样时尽可能地避免外界环境条件的影响，随机选取树冠中部不同方位、大小均匀、无病虫害的果实，每株10-20个果实，采后迅速放入采样装置中带回实验室。清水洗净，自然晾干，去皮后用组织捣碎匀浆机打浆，备用。随机称取1，00 g左右的果浆，按一定的料液比加入适量的去离子水，在超声辅助条件下进行提取、过滤，滤液稀释定容，即得样液待测。
1.2.2可滴定酸的测定方法 根据酸碱中和原理，以酚酞作指示剂，用移液管吸取定容至50 mL的待测液25 mL于250 mL锥形瓶中，加1%酚酞指示剂2滴，用已标定的NaOH溶液进行滴定。滴定至溶液初显粉红色并在0.5 min内不褪色时为终点（pH 8.1～8.3），记录NaOH滴定液用量，根据消耗的标定碱液量求出样品中可滴定酸的百分含量。以柠檬酸作为其换算系数即0.064，3次重复，以去离子水为空白对照，依据下面的公式计算果梅果实中有机酸含量。
1.2.3单因素试验
1）超声时间对有机酸提取量的影响：以去离子水为提取溶剂，在料液比1：10（g：mL，下同）、超声温度30℃、超声功率50 kHz，提取次数2次的条件下，分别超声提取10、20、30、40、50和60 min，考察不同超声时间对有机酸提取量的影响。
2）超声温度对有机酸提取量的影响：以去离子水为提取溶剂，在料液比1：10，超声时间30 min，超声功率50 kHz，提取次数为2的条件下，分别选择25、35、45、55、65和75℃的温度进行提取，然后考察不同超声温度对有机酸提取量的影响。
3）料液比对有机酸提取量的影响：以去离子水为提取溶剂，在超声温度35℃，超声时间30min，超声功率50 kHz，提取次数2次的条件下，分别选择料液比为1：5、1：10、1：15、1：20、1：25和1：30进行提取，然后考察不同料液比对有机酸提取量的影响。
4）超声功率对有机酸提取量的影响：以去离子水为提取溶剂，在料液比1：10、超声温度35℃、超声时间30 min、提取次数2次的条件下，研究超声功率为40、50、60、70、80和90 kHz对果梅果实有机酸提取效果的影响。
5）提取次数对有机酸提取量的影响：以去离子水为提取溶剂，在料液比1：10、超声温度35℃、超声时间30 min、超声功率50 kHz的条件下分别提取1、2、3和4次，然后测定有机酸含量。
1，2，4响应面法试验 综合单因素试验结果，选取料液比、超声功率、超声温度及超声时间为自变量，果梅果实提取有机酸的含量为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，采用4因素3水平的响应面分析试验，其因素与水平见表1。通过Design Expert 8.06软件对试验数据进行回归分析，预测果梅果实有机酸提取的最优工艺。
1.3数据分析方法
利用Excel 2003程序和Design Expert 8.06软件对试验结果进行分析。
2.结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1超声时间对有机酸提取量的影响 由图1可知，随着超声提取时间的延长，果梅果实有机酸提取量逐渐增加，当超声提取时间达到30 min时，提取量最大，之后随超声提取时间的延长，有机酸的提取量反而降低。可能是长时间的超声处理，挥发性有机酸的含量不断减少。另外超声时间越长，耗费的能量越多，故超声时间以30 min为宜。
2.1.2超声温度对有机酸提取量的影响 由图2可知，随着超声温度的不断增加，果梅果实有机酸提取量呈先增大后减小的趋势，当超声温度小于35℃时，果实有机酸提取量随着超声温度的升高而增加，当超声温度高于35℃时，果实有机酸随着超声温度的继续增加而下降。这可能是由于温度高和机械波的作用造成某些热敏感有机酸的损失。因此，选择超声温度35℃为宜。
2.1.3料液比对有机酸提取量的影响 由图3可知，果梅果实有机酸提取量随料液比的变化而变化，当料液比在1：5-1：20之间时，有机酸的提取量呈增加趋势；料液比为1：20时，有机酸的提取量达到最大，之后随着提取溶剂的增加有机酸的提取量不断降低。因此，选择料液比为1：20为宜。
2.1.4超声功率对有机酸提取量的影响 由图4可知，随超声波功率的增加，果梅果实有机酸提取量先增大后降低，超声功率在40～60 kHz范围内，有机酸提取量随超声功率的增大而升高，当超声频率为60 kHz时，有机酸提取量达到最高值。当超声功率继续增大时，有机酸的提取量反而下降。因此，选择超声功率60kHz为宜。
2.1.5提取次数对有机酸提取量的影响 由图5可知，随着提取次数的增加，果梅果实有机酸提取量越来越低，当提取次数为3时，有机酸提取量仅为0.30%，可见，经第2次提取后，有机酸的提取量已经很低，综合考虑产量和能耗等因素，选择提取2次为宜。
2.2响应面法优化果梅果实有机酸提取工艺
2.2.1响应面试验设计及结果 在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取料液比（X1），超声功率（X2）、超声温度（X3）及超声时间（X4）作为自变量，以有机酸的提取量作为响应值，共设29个试验点的响应面分析试验，其中24个为析因试验，5个为中心试验，试验方案及结果见表2。
采用Design Expert 8.06软件对试验数据进行回归分析，得到有机酸提取量与料液比（X1）、超声功率（X2）、超声温度（X3）、超声时间（X4）的二次多项回归方程：y=6.37-0.12X，-0.052X2+0.19X3+0.020X4+0.021X1X2-0.30X1X3-0.065X1X4-0.010X2X3-0.14X2X4-0.054X3X4-0.44X12-0.55X22-0.5 1X3-0.34X42。从方程中可以反映出各因素对提取量的影响程度，方程中各项系数绝对值越多，影响越大，系数的正负反映了影响的方向。
2.2.2响应面法优化回归方程的方差分析 由表3可知，该回归方差模型极显著（P=0.000 10.05，失拟性检验结果不显著。表明有机酸提取量（Y）实际值与预测值之间拟合程度较好，试验误差小，可用该模型分析和预测果梅果实有机酸超声提取的结果。对模型回归方程系数的显著性试验表明，一次项中X1的偏回归系数显著、X3偏回归系数极显著，交互项X1X3极显著，二次项中X1、X2、X3和X4均极显著，表明这些响应值对有机酸的提取具有显著影响。结合模型回归中的线性和回归方程系数显著性检验可知，对有机酸提取影响因素的大小顺序依次为超声温度、料液比、超声功率、超声时间。
2.2.3响应面的曲面分析 图6直观地反映了各因素对响应值的影响，在试验设定的水平范围内，随着每个因素取值的增大，其相应面值相应也增大，但当响应值达到最大值后，其不再随因素取值的增大而增大。从中可以看出，X1X2（P=0.822 7）、X1X4（P=0.0.4911）、X2X3（P=0.912 6）、X2X4（P=0.157 5）和X3X4（P=0.566 2）的等高线形状为圆形，曲面的陡峭程度较为平缓，交互作用较弱。X1X3（P=0.005 3）等高线为椭圆形，曲面较陡峭，反映其交互作用显著。
2.2.4最佳工艺条件的预测与检验 通过响应面优化得到果梅果实有机酸提取的最佳工艺方案为料液比1：18.86、超声功率59.40 kHz、超声温度36.26℃、超声时间30.21 min，预测有机酸提取量可达到6.40%。在最优条件下进行4组验证试验，所得果梅果实有机酸提取量为6.24%，与理论预测值的误差为0.16%。可见回归方程能较真实地反映各因素对果梅果实有机酸提取量的影响，由响应面法建立的回归模型具有可靠性，
3.小结
通过单因素试验和Box-Behnken试验设计以及响应面法，对超声提取果梅果实有机酸的工艺进行优化，得到的最佳工艺条件为料液比1：19、超声功率59 kHz、超声温度36℃、超声时间30 min，提取次数为2次。在此最佳工艺条件下，果梅果实有机酸的提取量为6.24%。