基于ITS2序列鉴别前胡和紫花前胡药材及其混伪品
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇基于ITS2序列鉴别前胡和紫花前胡药材及其混伪品范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
[摘要] 为应用ITS2序列对前胡、紫花前胡药材及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究，该文依据国家药典委员会公布的《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》，PCR扩增前胡、紫花前胡及其混伪品的ITS2序列并进行双向测序。经CodonCode Aligner V 3.7.1对测序峰图进行校对拼接，采用MEGA5.0软件分析相关数据。结果表明：前胡药材的ITS2序列长度为229～230 bp，种内变异较小，平均K2P遗传距离为0.005。紫花前胡药材的ITS2序列长度为227 bp，种内无变异。前胡、紫花前胡药材与其混伪品的种间平均K2P遗传距离分别为0.044，0.065。紫花前胡的种间最小K2P遗传距离明显大于其种内的最大K2P遗传距离。最小距离法和NJ树鉴定结果表明前胡、紫花前胡均能与其混伪品明显区分。因此，ITS2序列可有效鉴别前胡、紫花前胡药材及其混伪品。
[关键词] 前胡； 紫花前胡；混伪品；ITS2； 鉴别
中药材前胡Peucedani Radix为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根[1]。具降气化痰，散风清热的作用，用于治疗痰热喘满，咯痰黄稠，风热咳嗽痰多等症[1-3]。中药材紫花前胡Peucedani Decursivi Radix为伞形科植物紫花前胡P. decursivum （Miq.） Maxim.的干燥根[1]。具有疏风清热、下气化痰等功效，主要用于治疗风热头痛、痰热咳喘、呕逆、胸膈满闷等疾病。药理研究表明，紫花前胡挥发油的醇提物具有抑制癌细胞的生长和代谢作用[4]。前胡中一些吡喃类香豆素类具有钙离子拮抗活性，可治疗心血管疾病。近年来前胡和紫花前胡药材备受关注[5]，市场上混伪品也较多，如石防风P. terebinthaceum （Fisch.） Fisch ex Turcz.[6]、防风Saposhnikovia divaricata （Turcz.） Schischk.以及同属的滨海前胡P. japonicum Thunb[5]、泰山前胡P. wawrae （Wolff） Su和华中前胡P. medicum Dunn等作为伪品入药，严重影响了前胡和紫花前胡药材的质量和临床用药安全，对前胡和紫花前胡药材基原的准确鉴定已至关重要。目前尽管已采用性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱等技术对前胡药材及其混伪品进行了鉴别[5-8]。但由于传统鉴定方法的局限性，使前胡药材及其混伪品的准确鉴定相对困难。
DNA条形码（DNA barcoding）分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充，该方法有明确的鉴定标准和法定的鉴定指导原则有利于实现物种鉴定的标准化[9-10]。自Chen等[11]首次提出把ITS2作为药用植物鉴定的标准DNA条形码以来，ITS2条形码序列就备受关注[12-14]，已被广泛用于多种药用植物和药材的鉴定，表现出较强的鉴定能力[15-24]。本研究应用ITS2序列对前胡与紫花前胡药材及其同属密切相关种进行鉴定，为前胡和紫花前胡药材的快速准确鉴定提供了新的技术手段。
1 材料
本文所用材料共8个物种37个样品，包括实验样品及GenBank下载序列。
所有材料经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，凭证样本保存于中国医学科学院药用植物研究所。实验材料及GenBank下载序列信息见表1。
2 方法
2.1 DNA提取 为避免材料表面的污染，所有实验材料的前处理参照文献进行[25]。取约40 mg经前处理的材料，加入3% 的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），经研磨仪（Retsch MM400， Germany）充分研碎后加入DNA裂解液56 ℃ 水浴过夜，用氯仿-异戊醇（24∶1）抽提2 次，-20 ℃预冷的异丙醇中沉淀DNA，其余步骤按照试剂盒说明进行。
2.2 PCR扩增及测序 ITS2序列的PCR反应体系为25 μL，包括2×Easy Taq PCR SuperMix （TransGen Biotech Co.， China）12.5 μL，2.5 μmol・L-1引物各1 μL、模板DNA约50 ng，ddH2O补足至25 μL。PCR扩增用引物、扩增程序等参考Chen等[11]研究。PCR产物经纯化后，使用ABI 3730XL（ Applied Biosystems Co.，USA） 测序仪进行双向测序。
2.3 数据处理 测序峰图用CondonCode Aligner V3. 7. 1校对拼接，去除低质量序列及引物区，获得 ITS2 序列。所有序列经软件MEGA5.0进行变异位点分析和K2P（Kimura-2-parameter）遗传距离的计算。利用比对法（BLAST1）和最小距离法（Nearest distance）对前胡药材及其混伪品进行鉴定分析。用邻接 （NJ） 法构建系统聚类树， 利用bootstrap（1 000次重复） 检验各分支的支持率。
3 结果
3.1 前胡、紫花前胡药材ITS2序列的种内变异分析 前胡及紫花前胡药材ITS2序列经MEGA5.0分析比对后的片段长度、G+C含量等信息见表1。
不同来源的前胡药材的ITS2序列长度为229～230 bp，分为4个不同的单倍型（表1），单倍型A1序列全部与KJ680228相同，单倍型A2序列与KJ680226相同，与单倍型A1相比，在208 bp处缺失；KJ680230为单倍型A3，在228 bp处C-T变异； KJ680235为单倍型A4，在54 bp处T-G变异，在82 bp处、190 bp处T-C变异，在146 bp处C-T变异，在155 bp处A-C变异，在163 bp处A-G变异，在182 bp处A缺失。基于K2P模型计算的遗传距离表明，前胡药材its2序列的种内K2P遗传距离为0～0.023，平均K2P遗传距离为0.005。不同来源的紫花前胡药材的ITS2序列长度为227 bp，序列种内无变异，同为单倍型B1。
3.2 前胡、紫花前胡药材及其混伪品的种间变异分析 变异位点分析表明，前胡和紫花前胡的种间最小K2P遗传距离为0.081，显著大于前胡或紫花前胡的种内最大K2P遗传距离。前胡药材与其混伪品及同属密切相关种共28个样品的ITS2序列长度为224～230 bp，平均GC量为56.0%，平均种间K2P遗传距离0.044，显著大于前胡的种内最大K2P遗传距离。紫花前胡药材与其混伪品及同属密切相关种共27个样品的ITS2序列长度为224～229 bp，平均GC量为57.2%，平均种间K2P遗传距离0.065，最小K2P遗传距离为0.027，显著大于紫花前胡的种内最大K2P遗传距离。
3.3 前胡、紫花前胡药材及其混伪品的鉴定 基于比对法对前胡药材、紫花前胡药材及混伪品进行鉴定，结果表明， ITS2序列的物种鉴定效率为100%。应用最小距离法对前胡药材、紫花前胡药材及混伪品进行鉴定分析，结果表明，前胡和紫花前胡药材的基原物种ITS2序列的种内平均K2P 遗传距离均远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离。基于ITS2 序列构建的NJ 系统聚类树见图1，结果显示，前胡和紫花前胡分别聚为一支，但是泰山前胡也聚在前胡的一支中，说明泰山前胡与前胡的亲缘关系较近。其余近缘种或混伪品也都分别聚为一支。因此，ITS2序列作为条形码可快速准确鉴别前胡、紫花前胡药材及其混伪品。
4 讨论
4.1 紫花前胡的分类学地位研究 2005年版《中国药典》把伞形科前胡属植物白花前胡P. praeruptorum和紫花前胡P. decursivum列为前胡药材的2个基原。后续研究表明，不仅白花前胡和紫花前胡的化学成分差异较大，而且其药材的形态也存在差异[7，26]，依据中药趋向于采用单一或相近来源可同等入药的原则，2010年版《中国药典》把紫花前胡作为一个新增的药材单列出来，不再是前胡药材的基原植物[1]。事实上，关于紫花前胡的分类学地位，一直存在争议，尽管《中国药典》中把紫花前胡列为伞形科前胡属植物，而《中国植物志》则把紫花前胡学名修订为当归属植物Angelica decursiva （Miq.） Franch. et Sav[27]，导致紫花前胡的学名无法统一，相关文献中的学名使用相对混乱。因此，尽快澄清紫花前胡的分类学地位已迫在眉睫。刘向前等[28]利用HPLC对8种当归属植物中紫花前胡素的含量进行了比较，表明紫花前胡和其他当归属植物一样含有较多的紫花前胡素。刘春生等[26]、薛华杰等[29]利用幼嫩叶片为材料，通过获得ITS序列，对紫花前胡和当归属的毛当归、白芷、骨缘当归等进行了分类学地位的进行了研究，支持紫花前胡应归属为当归属植物。泰山前胡在我国部分地区被做为前胡使用，从图1可以看出，白花前胡和泰山前胡亲缘关系较近，为泰山前胡在某些地区做前胡使用提供了一定的理论依据，该结果与已有报道一致[26]。本文研究结果表明，紫花前胡与朝鲜当归的种间平均K2P遗传距离为0.029，显著小于紫花前胡与前胡的种间平均K2P遗传距离0.095，表明紫花前胡与朝鲜当归的亲缘关系更近，基于ITS2 序列构建的NJ系统聚类树明确显示紫花前胡和朝鲜当归聚为一大支，同样支持紫花前胡应归属为当归属植物。
4.2 前胡及紫花前胡药材鉴定的稳定性和准确性 中药鉴定的新方法新技术应具有方法通用性，可数字化，可重复性及样品处理简单，实用性强等特点，同时鉴定的结果务必具有较强的稳定性和准确性[30]。
作为新兴的中药鉴定方法，中药材DNA条形码分子鉴定指导原则中明确指出，DNA条形码技术通过精密度考察和方法适用性考察，确保鉴定结果稳定、可靠[9]。目前已通过对山茱萸[18]、秦艽[19] 、金银花[20] 、羌活[25]等药材DNA条形码的分析，验证了ITS2条形码序列用于中药鉴定的稳定性和准确性。本研究通过改良的基因组DNA提取试剂盒可以成功提取不同来源的前胡和紫花药材的基因组DNA，尽管有些药材的存放时间较长，DNA部分降解，但由于ITS2序列具有多拷贝的特点[13，31-32]，通过PCR扩增仍可成功获得完整的ITS2序列。薛华杰等[29]采用紫花前胡的新鲜叶片叶获得了其ITS/ITS2序列，说明ITS2序列作为前胡及紫花前胡药材的DNA条形码具有很好的稳定性。基于K2P遗传距离分析表明，紫花前胡的种内最大K2P遗传距离小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离，表明ITS2序列可准确鉴别前胡和紫花前胡药材、近缘物种及其混伪品。
[参考文献]
[1] 中国药典.一部[S]. 2010.
[2] 黄冬兰， 徐永群，陈小康. 红外二阶导数谱法快速鉴别前胡及伪品防风[J].韶关学院学报：自然科学，2009，30（12）：50.
[3] 张村， 肖永庆， 李丽. 白花前胡化学成分研究（Ⅴ）[J].中国中药杂志， 2012， 37（23）： 3573.
[4] 许剑锋， 孔令义. 紫花前胡茎叶化学成分的研究[J].中国中药杂志， 2001， 26（3）： 178.
[5] 兰瑞芳， 郑曦， 林少琴. 滨海前胡与白花前胡的化学成分比较[J].海峡药学，2000，12（2）：45.
[6] 周燕. 前胡及其混淆品石防风的鉴别[J].中国药业，2008，17（14）：62.
[7] 周国莉， 刘宇婧， 任守利， 等. 白花前胡和紫花前胡挥发油成分的分析[J].湖北中医药大学学报， 2010，30（5）：26.
[29] 薛华杰， 闫茂华， 王年鹤，等. 基于ITS序列研究当归属、前胡属间的关系与紫花前胡的分类地位[J].南京师范大学学报，2007，30（3）：97.
[30] 陈士林， 郭宝林， 张贵君， 等. 中药鉴定学新技术新方法研究进展[J].中国中药杂志，2012，37（8）：1043.
[31] Hollingsworth P M. Refining the DNA barcode for land plants[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2011， 108（49）：19451.
[32] Coleman A W. Pan-eukaryote ITS2 homologies revealed by RNA secondary structure[J]. Nucl Acids Res， 2007， 35（10）：3322.
Identification of Peucedani Radix， Peucedani Decursivi Radix and its
adulterants using ITS2 sequence
HOU Dian-yun1，2， SONG Jing-yuan2， YANG Pei2， ZHOU Hong2， XIN Tian-yi2， YAO Hui2*
（1. Agricultural College， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471000， China；
2.The National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，
Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union
Medical College， Beijing 100193， China）
[Abstract] In order to identify Peucedani Radix， Peucedani Decursivi Radix and their adulterants， the internal transcribed spacer 2 （ITS2） regions of Peucedani Radix， Peucedani Decursivi Radix and their adulterants were amplified and bidirectionally sequenced based on the Principles for Molecular Identification of Traditional Chinese Materia Medica Using DNA Barcoding， which has been promulgated by Chinese Pharmacopoeia Commission. Sequences were analyzed and assembled by Codon Code Aligner V3.7.1. The relevant data were analyzed by MEGA 5.0. Species identification analyses were performed by using the nearest distance methods and neighbor-joining （NJ） methods. The result showed that the ITS2 sequence lengths of Peucedani Radix were 229-230 bp and the average intra-specific genetic distances were 0.005. The ITS2 sequence lengths of Peucedani Decursivi Radix were 227 bp and the sequences contained no variation site. The average inter-specific K2P genetic distance of Peucedani Radix， Peucedani Decursivi Radix and their adulterants species were 0.044 and 0.065 respectively. The minimum inter-specific divergence is larger than the maximum intra-specific divergence of Peucedani Decursivi Radix. The nearest distance methods and NJ trees results indicated that Peucedani Radix， Peucedani Decursivi Radix and their adulterants species could be identification clearly. The ITS2 regions can stably and accurately distinguish Peucedani Radix， Peucedani Decursivi Radix and their adulterants.
[Key words] Peucedani Radix； Peucedani Decursivi Radix； adulterants； ITS2； identification
doi：10.4268/cjcmm20142120