吡格列酮对家兔局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响
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[摘要] 目的 探讨吡格列酮对脑缺血再灌注损伤家兔细胞凋亡的影响及其机制。 方法 40只雄性家兔随机分为5组：①假手术组（S组，n = 8）；②模型组（M组，n = 8）；③吡格列酮组（P组，n = 8）；④GW9662+吡格列酮组（GP组，n = 8）；⑤DMSO组（D组，n = 8）。除S组外，其余各组均通过线栓法建立家兔大脑中动脉阻塞（MCAO）再灌注损伤模型。于术前30 min分别给予相应处理。缺血120 min再灌注24 h后，对家兔进行神经功能评分；HE染色观察病理形态学，TUNEL检测神经细胞凋亡。 结果 ①与S组比较，M组神经功能评分明显增加（P < 0.05）；与M组比较，P组神经功能评分明显降低（P < 0.05）。②与S组比较，M组凋亡细胞明显增加（P < 0.05）；与M组比较，P组凋亡细胞明显降低（P < 0.05）。 结论 吡格列酮可通过减轻形态学改变、抗神经细胞凋亡，对神经细胞发挥保护作用。
[关键词] 吡格列酮；GW9662；脑缺血/再灌注；细胞凋亡
[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）04-0001-03
近年研究表明，PPARγ表达的升高对于脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用[1]，已成为脑血管病研究领域中的热点课题。作为PPARγ的激活配体――吡格列酮（pioglitazone，PGZ）临床上广泛应用于治疗2型糖尿病，但有研究表明其对脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用[2]，而具体机制尚未完全阐明。本实验采用家兔局灶性脑缺血再灌注模型，应用PGZ进行预处理，观察其对家兔术后神经功能及细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组
清洁级雄性家兔40只，重量750～1 000 g。术前12 h禁食不禁水，随机分为5组，每组8只：①假手术组（S组）；②模型组（M组）；③吡格列酮组（P组）；④GW9662+吡格列酮组（GP组）；⑤DMSO组（D组）。
1.2 试剂
吡格列酮、GW9662和10%二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，美国）；原位末端标记（TUNEL）试剂盒（Promega公司）；电子显微镜（Olympus，日本）等。
1.3 动物模型制备及处置
M组：术前20 min经耳缘静脉注射生理盐水2 mL/kg，采用改良的Zea-longa[3]法制备家兔大脑中动脉阻断（MCAO）模型。缺血120 min后抽出线栓即可造成再灌注模型。模型成功标志：苏醒后出现左侧Horner综合征；爬行时向右侧转圈或跌倒。P组：术前20 min经耳缘静脉注射吡格列酮10 mg/kg。GP组：术前20 min先经耳缘静脉注射GW9662，剂量是0.3 mg/kg[4]，5 min后再经耳缘静脉注射吡格列酮10 mg/kg。D组：术前20 min经耳缘静脉注射10% DMSO 2 mL/kg。S组：术中分离左侧CCA、ICA及ECA，但不做任何缺血处理。
1.4 指标检测
1.4.1 神经功能评分 再灌注24 h后采用双盲法按Zea-longa 5分法进行神经功能评分，标准如下：①无神经功能缺失症状，计0分；②不能伸展右侧前肢，计1分；③爬行时向右侧转圈，计2分；④身体向右侧倾倒，计3分；⑤不能自发爬行、意识障碍，计4分。
1.4.2 HE染色 将各组8只家兔麻醉，以生理盐水进行心脏灌洗，用4℃ 10%多聚甲醛灌洗固定，并迅速断头取脑。距额叶前端3 mm和9 mm处进行冠状分离，取中间6 mm厚的脑组织块，然后沿此脑块矢状缝两侧约2 mm处，从上至下切去两侧半球的正中结构，将左侧脑块作为缺血脑组织，制成蜡块。自前往后连续冠状位切片，厚约5 μm。HE染色光学显微镜下（400×）观察神经细胞形态学变化并采图。
1.4.3 TUNEL染色 严格按照试剂盒检测步骤进行操作。TUNEL染色在光镜下（400×）观察凋亡细胞（以胞核出现棕黄染色颗粒代表），计算TUNEL阳性率即TUNEL阳性细胞数占总细胞数的比值并采图。
1.5 统计学处理
应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。神经功能评分中位数/四分位数法表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Nemenyi检验。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般状况及神经功能改变
S组家兔对外界反应灵敏，其余4组家兔对外界反应灵敏度不同程度降低，其中以M组最迟钝，P组最佳。5组家兔神经功能评分比较见表1。
2.2 HE染色的比较
切片经HE染色后，光镜下可见S组神经细胞形态正常，胞质色淡且均匀，核大而圆，核仁明显（图1A）。M组呈明显的缺血损伤性改变，多数细胞体积缩小，胞浆疏松，胞核固缩深染，部分细胞坏死（图1B）。经吡格列酮预处理的P组缺血性损伤改变较M组明显减轻，坏死区域缩小（图1C），而GP与D组较M组的缺血改变则无明显减轻，可见神经细胞正常结构消失，部分细胞出现坏死（图1D和图1E）。
2.3 TUNEL染色的比较
S组只有少量凋亡细胞（图2A），与其余4组大鼠相比差异均有统计学意义（P < 0.01）。M组凋亡细胞阳性率为（63.06±9.05%，图2B），而经吡格列酮预处理的P组相应区域凋亡细胞阳性率（48.10±7.61%，图2C），两组相比差异也有统计学意义（P < 0.01），而GP与D组较M组的细胞凋亡率则无明显改变。5组大鼠脑组织中凋亡细胞率比较见表1。
3 讨论
既往研究表明，脑缺血再灌注时神经细胞可介导大量炎性细胞的聚集和炎性因子的释放[5]，造成神经元凋亡，从而造成对缺血损伤区域细胞的损伤。本研究也发现模型组中细胞凋亡数量相比假手术组显著升高。有研究发现，PPARγ激动剂能活化细胞外信号调节激酶而抑制NF-κB的激活[6]。NF-κB可调控表达许多参与炎症反应、氧化损伤、免疫反应和细胞凋亡等过程的蛋白基因。持续活化在垂死神经元中的NF-κB可诱导细胞凋亡，包括重新进入细胞循环失败和生成死亡蛋白[7]；炎症反应过程中释放一系列细胞因子信号降解IκB的激酶（IKK）活化并磷酸化IκB的两个Ser残基，释放出与IκB相结合的NF-κB并转移到细胞核而使目的基因的表达增加，从而产生大量的炎症介质参与病理生理过程[8，9]。
吡格列酮作为PPARγ特异性激动剂，目前在临床主要用于治疗2型糖尿病。国内有研究报道，吡格列酮促进PPARγ mRNA和蛋白的表达，增强其对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用，并且与剂量成正比[10]。本实验发现经吡格列酮预处理后的家兔神经功能缺损较模型组明显改善，缺血半暗带的顶叶皮质中细胞凋亡数量明显减少。由此我们认为吡格列酮可通过减少细胞凋亡而达到神经保护的作用；若事先静脉注射GW9662[11]后再给予吡格列酮，则可逆转吡格列酮的上述保护作用；同样，单独行DMSO预处理后的大鼠在相关方面未得到明显的改善。
除此之外，从脑组织病理形态学比较来看，模型组家兔脑组织变性坏死的细胞明显高于其余四组且主要分布于缺血半暗带的顶叶皮质，主要表现为神经细胞坏死，表明再灌注后缺血半暗带发生了明显的细胞变性坏死反应，符合缺血缺氧性病理变化；而经吡格列酮预处理组家兔脑组织则以神经细胞肿胀为主，表明吡格列酮具有抗细胞坏死作用，在一定程度上挽救了受损的神经细胞，对缺血再灌注脑损伤起到一定的保护作用；而预先给予GW9662后再行吡格列酮预处理及单独行DMSO预处理的家兔脑组织病理形态学方面均无明显改善，提示吡格列酮具有阻止或延缓神经细胞坏死，对保护缺血再灌注后神经细胞损伤具有积极意义，而GW9662则可逆转吡格列酮抗细胞坏死的效应。
由此可见，吡格列酮可通过减轻家兔缺血再灌注后的损伤，从而很好地减少细胞凋亡，为该药在缺血性脑血管疾病的临床使用提供一定的理论依据。
[参考文献]
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（收稿日期：2012-11-05）