TDZ和NAA对老鸦瓣不定芽诱导和丛生芽增殖的影响

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[收稿日期] 2014-01-20

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81202867）

[通信作者] *郭巧生，Tel：（025）84395980， E-mail：；*赵桂华，Tel：（0511）87290298， E-mail：

[摘要] 以老鸦瓣鳞茎芯芽和子茎（芽茎顶端膨大形成的子鳞茎）为外植体，探索噻苯隆（tdz）和α-萘乙酸（naa）诱导老鸦瓣外植体直接成芽的方法，建立老鸦瓣器官途径丛生芽组培体系。研究结果表明，芯芽和子茎在MS+TDZ 2.0 mg・L-1+NAA 2.0 mg・L-1和MS+TDZ 2.0 mg・L-1+NAA 4.0 mg・L-1培养基中可直接诱导不定芽，芽诱导率分别为72.92%，79.22%；利用子茎不定芽在MS+TDZ 0.2 mg・L-1+ NAA 0.2 mg・L-1培养基中可进行丛生芽增殖，增殖系数2.23，形成的芽体健壮，叶色嫩绿；增殖后的丛生芽在含有IBA 1.0 mg・L-1的MS培养基中即可生根，生根率52.6%，平均3～5条根。利用老鸦瓣芯芽和子茎，筛选出了老鸦瓣芯芽和子茎直接诱导不定芽及丛生芽增殖和生根的最适培养基，建立了器官途径丛生芽组培体系。

[关键词] 老鸦瓣；芯芽；子茎；不定芽；丛生芽；组织培养

老鸦瓣Tulipa edulis （Miq.） Baker 为百合科郁金香属多年生药用植物，生长在山坡草地及路旁，在我国主要分布于辽宁、山东、江苏、浙江、安徽、江西、湖北、湖南和陕西等地，朝鲜、日本也有分布[1]。中药材光慈姑为其地下鳞茎去掉膜质皮及绒毛后的干燥鳞茎，味甘辛，性寒，有毒，具有散结化瘀之功，主治咽喉肿痛，瘰疬，痈疽，疮肿，产后瘀滞[2]。光慈姑药材主要来源于野生老鸦瓣，由于近年来发现其在乳腺疾病等方面的显著治疗效果[3]，导致中药产业对光慈姑的需求激增，加上药农无节制的采挖，使得野生资源日渐枯竭[3-6]。光慈姑生理生物学特性及栽培繁育等方面的研究，为人工栽培奠定了一定基础，但种苗繁育问题仍是其规范化栽培的主要障碍。组培方面的初步研究，是以老鸦瓣全鳞茎和芯芽[7]、及芯芽产生的芽茎[8]为外植体，建立了组培苗体系。但组培苗因其较低的驯化移栽成活率无法满足生产需求；而试管鳞茎因有较强的适应环境和抗逆能力，成为衔接组培微环境和大田生产的有效途径。本试验对老鸦瓣鳞茎打破休眠后的芯芽及芽茎产生的子茎进行离体培养，研究外植体直接成芽以及丛生芽的继代增殖，以期为建立老鸦瓣试管鳞茎的离体快繁体系提供依据。

1 材料

供试材料为处于休眠期的老鸦瓣鳞茎，重约2.0 g/个，采自安徽省阜南县，经南京农业大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为老鸦瓣T. edulis。

2 方法

2.1 基本培养基和培养条件 基本培养基为MS培养基分别附加琼脂6.3 g・L-1，蔗糖30 g・L-1，pH 5.8，经121 ℃高温灭菌20 min，如无特殊说明，培养温度为（25±2） ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h・d-1。

2.2 鳞茎预处理 采自安徽省阜南县的老鸦瓣鳞茎，洗去泥沙，沥干水分，以400倍液50%多菌灵可稀释粉剂浸泡处理20～30 min，清水洗去药液，室内晾3～5 d。将鳞茎与灭过菌的潮湿的细河砂（河砂先经135 ℃干热灭菌4 h，湿沙含水量约6%～8%）以1∶3混匀，装于自封袋中，不完全密封以透气。分别放置在自然室温、0～2 ℃下沙藏处理80～120 d，定期查看水分情况，拣出霉烂者。

2.3 外植体消毒 沙藏老鸦瓣鳞茎，除去绒毛层，饱和洗衣粉溶液清洗3次，用解剖刀将鳞茎剖开，分成2块完整的鳞片和带基部芯芽。先经饱和洗衣粉溶液清洗3次，流水冲洗2 h。移至超净工作台，于75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1% HgCl2[含数滴聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温-80）]消毒15～20 min，无菌水冲洗4～5次，吸干水分。

2.4 更新鳞茎、鳞片等外植体直接诱导不定芽 取自然沙藏老鸦瓣蕾期更新鳞茎、蕾期鳞片和0～2 ℃沙藏老鸦瓣鳞茎的冷藏鳞片、芯芽、膨大期的芽茎顶端子茎为外植体，将鳞茎剥离成2块完整鳞片和带基部芯芽，膨大初期的芽茎顶端子茎则带外皮消毒。

将以上切下的各部分，按照2.3所示方法消毒后，接入MS培养基2周后获得无菌外植体，转入A1～A10各不同培养基，芯芽为基部插入培养基、鳞片凹面朝下接入培养基、子茎则连同芽茎段切口水平接入培养基。每处理接种20个外植体（A6，A7处理各接种12块），均重复3次。3个月后统计不同外植体在各培养基中的诱导分化情况。激素和外植体处理组合为利用均匀设计软件生成，见表1。

2.5 芯芽外植体直接诱导不定芽 以自然沙藏转4 ℃冷藏后的生根至萌芽期的老鸦瓣鳞茎芯芽为材料，考察NAA质量浓度为1.0 mg・L-1时，不同质量浓度TDZ（0，0.5，1.0，2.0，4.0 mg・L-1）对芯芽诱导不定芽的影响；再以即将进入生根期的老鸦瓣鳞茎芯芽为材料，在TDZ质量浓度为2.0 mg・L-1时考察不同生长素NAA质量浓度（0，0.5，1.0，2.0 mg・L-1）对芯芽诱导不定芽的影响。培养条件除进行遮光暗培养外，其他同初代诱导。每处理重复2次。3个月后统计不定芽诱导情况。

2.6 不定芽增殖 将子茎侧生丛生芽诱导验证实验中得到的子茎侧生丛生芽连带子茎少量基部切下，分割成3～5个小芽一簇，接入各芽增殖培养基中，进行芽继代增殖。每处理接种12个小芽丛，重复3次。定期观察记录芽生长状况，3个月后，计算芽增殖系数。

2.7 试管苗生根 将增殖后的丛生芽分成3～5个芽一簇，高3 cm左右的小芽丛，接种于D1（MS+IBA 1.0 mg・L-1），D2（MS+NAA 0.5 mg・L-1），D3（1/2MS+IBA 1.0 mg・L-1），D4（1/2MS+NAA 0.5 mg・L-1）生根培养基中。 每处理接种15丛小芽，重复3次。45 d后查看苗生长状况，统计生根率。

2.8 数据统计 实验所得数据用Excel和SPSS 18.0软件处理。

愈伤组织率= 形成愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100%

不定芽或子茎率=形成的不定芽或子茎的外植体数/接种外植体数×100%

侧生总不定芽率=有侧生不定芽的外植体数/接种外植体数×100%

环生或簇状丛生芽率=有环生或簇状丛生芽的外植体数/接种外植体数×100%

平均芽数（子茎数）= 形成的芽（或子茎）总数/产生芽（或子茎）的外植体数

增殖系数=增殖后芽总数/接入的芽总数

生根率=生根的芽丛总数/接种的芽丛数×100%

3 结果

3.1 外植体直接诱导不定芽 研究结果表明，外植体能否直接诱导不定芽形成，取决于培养基中添加的生长调节物质、外植体取材时期、取材部位和自身的生理状态。冷藏鳞片和蕾期鳞片，虽然都取自老鸦瓣鳞茎，但二者诱导结果差异显著，见表2。冷藏鳞片接入培养基中，形成不定芽或子茎概率较小（A5，A8）；而蕾期鳞片虽有一定的不定芽或子茎率，但也仅限于少数鳞片上长出单个鳞芽或小鳞茎（A6，A7）。二者的差别在于，前者的鳞茎处于生根萌动时期，后者鳞茎处于生殖生长旺盛时期；取材时期的差别，再加上鳞片自身所含的高淀粉量，以及沙藏鳞茎导致鳞片消毒彻底比较困难，最终造成鳞片在培养基中启动培养率低。更新鳞茎与培养基接触的部位是鳞茎基部，接种后慢慢裂开，露出芯芽，培养2个月后，芯芽上长出不定芽，因此也仅有少量的不定芽形成。芯芽外植体取自打破休眠的老鸦瓣鳞茎，自身的细胞组织活跃，接入培养基后，能迅速启动，逐渐变绿，基部容易长出愈伤组织和不定芽（A9，A10）。

子茎外植体取自芽茎顶端膨大期，正处于发育成新鳞茎时期，生理状态活跃，并且带外皮消毒，受消毒剂的毒害作用小，接入培养基（A1，A3）后，基部会形成环状丛生、紧密排列的不定芽，具有较高的芽诱导率，由此子茎是直接诱导不定芽的适宜外植体。根据试验结果，运用均匀设计软件对不定芽得率进行外植体和激素配比优化，得出子茎外植体在MS+TDZ 2.0 mg・L-1+ NAA 4.0 mg・L-1的培养基中具有最优的不定芽得率68.99%。验证试验结果表明，子茎诱导不定芽得率为72.92%，说明验证结果符合预期优化值。虽然芯芽和蕾期鳞片也可以诱导出不定芽，但综合考虑外植体消毒、取材难易程度及材料的利用度等方面，最终确定子茎为最佳外植体，并且在含有TDZ 2.0 mg・L-1，NAA 4.0 mg・L-1的MS培养基中诱导不定芽效果最好。

3.2 芯芽外植体直接诱导不定芽 以老鸦瓣鳞茎打破休眠后的芯芽为外植体，取材统一，生理时期相同。并且由于芯芽鳞片的包裹，相对于鳞片和子茎等污染较少，消毒容易，启动培养率更高。因此芯芽是除子茎外适宜诱导不定芽的外植体。芯芽接种1个月后，幼叶从内部长出，近基部形成少量乳突状新生不定芽原基，继续培养一段时间后，芯芽近基部形成环生或簇状丛生的不定芽。

在NAA质量浓度为1.0 mg・L-1时，随着TDZ浓度的升高，侧生丛生不定芽率和平均芽数都呈先增加后降低的趋势；以TDZ质量浓度为2.0 mg・L-1时芯芽诱导侧生丛生芽率最大，平均芽数最多。当TDZ质量浓度为4.0 mg・L-1时芯芽诱导侧生丛生不定芽率下降，芽数减少。可见芯芽诱导不定芽时，TDZ的最适质量浓度是2.0 mg・L-1。试验发现芯芽接种1个月后即有丛生不定芽产生，说明老鸦瓣鳞茎由自然室温沙藏转至低温处理后，可促进鳞茎打破休眠，得到的芯芽生理状态较好，见表3。

以TDZ质量浓度为2.0 mg・L-1，考察NAA浓度变化对芯芽诱导不定芽的影响，见表4。当TDZ浓度不变时，不论NAA的浓度高低，都有很高的侧生不定芽形成率。当NAA浓度为2.0 mg・L-1时，平均芽数和环生或簇状丛生芽率都达到最大，但侧生不定芽率有所降低；可见TDZ存在的条件下，NAA浓度稍高有利于环状或簇状丛生芽的诱导。而实际培养中，环生或簇状丛生芽不利于芽丛切分单芽，继代增殖容易长畸形粘连的芽，侧生不定芽呈独立状，有利于切分单芽进行芽增殖。因此，选择NAA质量浓度为2.0 mg・L-1，配合TDZ使用，较为合适。本试验还发现丛生芽诱导历时较长，可能与芯芽尚未完全打破休眠有关。因此，以芯芽为外植体时，应该将老鸦瓣鳞茎沙藏后低温处理，以提高芯芽的生理活性；芯芽诱导不定芽的适宜培养基为MS+TDZ 2.0 mg・L-1+ NAA 2.0 mg・L-1。

3.3 不定芽增殖 将子茎基部不定芽切分后，接种到4种芽增殖培养基中，3个月后，统计高于0.5 cm的芽，见表5。在各增殖培养基中，都有芽增殖的现象，其中以C1处理（TDZ 0.2 mg・L-1，NAA 0.2 mg・L-1）的丛生芽增殖效果最好，增殖系数2.23，芽体健壮，呈纺锤形独立芽。当TDZ质量浓度较高（2.0 mg・L-1）时，增殖的芽多偏畸形，可能是由TDZ很强的细胞分裂素作用，而此时生长素NAA浓度较低，造成分化和生长不均而变成畸形，也可能是由于子茎初代诱导不定芽阶段使用的TDZ和现阶段使用的TDZ同时聚集在此发挥了“激素累积”作用。由此看来，TDZ作用下子球形成的丛生芽增殖时，适宜较低浓度的TDZ和低浓度的NAA。所以，适宜的子茎丛生芽增殖培养基为MS+ TDZ 0.2 mg・L-1+NAA 0.2 mg・L-1。

3.4 生根培养 丛生芽转入生根培养后，因培养基的成分不同，生根效果不同。4种培养基都能生根，但以MS+IBA 1.0 mg・L-1处理有最高的生根率52.6%。1/2MS 培养基中，丛生芽基部多生乳白色、细长的毛细根；MS培养基中所生的根比1/2MS培养基中所生的根，稍粗稍短，且平均根数3～5条。实验发现各处理诱导生根的时间都稍长，可能与外植体来源和材料本身生根能力差异有关。由于本研究是为老鸦瓣组培苗诱导试管鳞茎建立基础，可不需生根培养，所以在此未进行生根培养见图1～3。

4 讨论

植物组织培养中，经外植体诱导愈伤组织，进而分化出不定芽的途径，因其比较高的繁殖系数，已经应用的比较广泛。本研究采用老鸦瓣子茎或芯芽外植体直接诱导不定芽，继而进行丛生芽增殖的途径，省去了外植体诱导愈伤组织，再由愈伤组织分化出不定芽的阶段，既避免了因诱导愈伤组织时可能产生的变异，又缩短了由外植体到组培苗的整个诱导周期，成为继由老鸦瓣芽茎诱导愈伤后分化不定芽[8]的另一条途径。

郁金香组织培养中，已有研究发现由鳞片直接再生芽是最佳的繁殖途径[9]，也有研究使用花托、花茎[10]、鳞片[11-12]作外植体，直接诱导小鳞茎，平均每块外植体直接再生小鳞茎10个以上。Nishiuchi[13]研究发现使用2，4-D和KT，郁金香鳞片在试管中可直接诱导不定小鳞茎。这种器官诱导效应的不同，可能与植株的发育时期有关[14]。本实验中，也发现类似的结果由鳞片上直接诱导出小鳞茎或不定芽，但数量较少，可能是鳞片中淀粉含量比较高，细胞组织活力较低，启动培养需要的时间较长的原因。

邴其忠[7]曾使用6-BA和NAA共同作用诱导光慈姑全鳞茎和芯芽产生愈伤组织，再分化出不定芽。而Podwyszyska等[15-16]早期研究发现，在培养基中添加TDZ以代替6-BA和2iP，可以明显的提高花茎外植体上初代再生结果；几乎100%的花茎外 植体，在2～3个月里，都能再生出多于10个的芽。而单独使用TDZ或NAA，形成的胚状体结构较少。目前研究表明TDZ能引起类似细胞分裂素作用，活性强于6-BA[17]。这种高活性的分裂素通常用来离体培养的建立和有难度物种的增殖，有效的提高愈伤组织、不定芽或者胚的形成[18]。本试验中使用的外植体主要为子茎，其特定的形成方式和含有的物质成分，使其启动培养花费的时间较长[7]。因此选择TDZ为主要激素，与NAA配合使用，以诱导老鸦瓣子茎产生环生簇状丛生芽。但是在培养过程中，长时间使用高浓度TDZ（2.0～4.0 mg・L-1）会诱导叶片发生变化，形成扁平状叶或畸形结构[15-16]，本试验也验证了这点。所以在今后的研究中应注意TDZ的使用浓度。

老鸦瓣冷藏芯芽产生的芽茎诱导愈伤组织后分化出的丛生芽，因纤细而看起来略显柔弱，而芯芽和子茎在TDZ作用下产生的丛生芽，芽体短而粗壮，色泽嫩绿，生长旺盛，可为下步试管鳞茎诱导工作提供更多组培苗，这样既拓展了初代诱导外植体的来源，也丰富了培养途径，有利于研究试管鳞茎的发生途径。试管鳞茎代替试管苗，作为组培微繁殖和大田生产衔接的关键环节，省去了炼苗环节，能增加抗逆性、提高移栽成活率，有着不可忽视的作用。目前已经诱导出老鸦瓣组培苗，下步工作重点是试管鳞茎诱导以及诱导出的试管鳞茎移栽萌发。

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