丹参酮ⅡA磺酸钠降解产物的分离纯化及其结构鉴定

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摘 要 丹参酮ⅡA磺酸钠（STS）原料水溶液经加热降解，采用制备高效液相色谱法对其有关物质进行分离纯化，获得两个HPLC纯度大于95%的组分A （99.0 mg）和B（95.0 mg）。经MS和NMR结构解析，确证为1-羟基丹参酮ⅡA磺酸钠和1，2-脱氢丹参酮ⅡA磺酸钠。本工作为STS原料和制剂的质量控制和稳定性研究提供有关物质对照品，以保证其质量可控。

关键词 丹参酮ⅡA磺酸钠 分离纯化 结构鉴定

中图分类号：R284.1； TQ460.7 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2014）11-0054-04

Isolation and structure characterization of the

degradated products of sodium tanshinoneⅡA sulfonate*

JU Shu**， HONG Yong， Huang Zhenhui***

（Shanghai No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co. LTD.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Two related substance A （99.0 mg） and B （95.0 mg） with HPLC purity over 95% were collected by heat degradation of the solution of sodium tanshinoneⅡA sulfonate （STS） followed by isolation and purification with the reversed phase preparative high performance liquid chromatography （Pre-HPLC）. They were finally identified as sodium 1-hydroxyltanshinoneⅡA sulfonate and sodium 1，2-dehydrotanshinoneⅡA sulfonate by analysis of MS and NMR. These two related substances verified can be used as references for the quality control and stability study of STS materials and preparations..

KEY WORDS sodium tanshinoneⅡA sulfonate； isolation； structure characterization

丹参酮ⅡA磺酸钠（sodium tanshinoneⅡA sulfo-nate， STS），为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhza）中分离的脂溶性二萜醌类化合物丹参酮ⅡA经磺化而得到的水溶性磺酸盐。由于其具有抗氧化活性，抗缺氧，减少血栓形成[1]，能够降低缺血再灌注所产生的心肌线粒体脂质体过氧化物的含量、改善心肌线粒体膜的流动性、促进侧支循环建立、改善心脏代谢及有效增加冠状动脉流量，对冠心病心绞痛及胸闷等有显著疗效[2-6]；还具有抗菌消炎、治疗肝病、肾病等方面的作用[7-8]；其注射剂已在临床上广泛使用。现代药学研究表明，丹参中化学成分复杂，主要为水溶性丹参酚酸类和脂溶性二萜醌类丹参酮类化合物。丹参酮类化合物主要含有丹参酮Ⅰ、ⅡA、ⅡB、异丹参酮Ⅰ、ⅡA、隐丹参酮、异隐丹参酮、甲基丹参酮、羟基丹参酮等[9]，其化学结构复杂且相近，化学全合成难度大，常规的分离纯化技术难以得到单一的组分，但随着制备液相分离技术的发展，使获得单体组分成为可能。

丁小军[10]采用反相和凝胶色谱法分离纯化STS原料粗品，得到了10 mg 1，2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠；Zou等[11]采用重结晶和制备色谱纯化STS原料，得到了1，2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠和紫丹参甲素磺酸钠的混合物；Wang等[12]采用重结晶和制备色谱纯化STS原料，从50 g STS原料得到15 mg 1 -羟基丹参酮IIA磺酸钠、12 mg 1，2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠；秦引林[13-14]采用制备硅胶板从10支STS水针制剂中分离得到10 mg 1-羟基丹参酮IIA磺酸钠，采用醋酸和铬酸部分氧化STS法定向合成出1-羟基丹参酮IIA磺酸钠200 mg。但从STS原料药或水针制剂中提取有关物质，由于其含量通常只有千分之几，不易获得。

STS原料和制剂在制备、储存过程中因pH、光照、温度和氧化等环境因素而导致降解，会出现酸性增强、含量降低等现象。随着药品质量标准提高，ICH指导原则要求尽可能提供大于0.1%的所有有关物质结构，并阐述可能产生的机制、构效关系和药理、毒理数据等。因此，有必要规模化制备STS原料有关物质。本研究为了反映STS药物真实的稳定性，综合现有技术、方法，采用高温破坏试验强制降解高纯度的STS原料，运用制备色谱分离纯化其降解产物，推测其可能的降解途径，以更加安全简便的方法为产品工艺设计、质量控制和稳定性研究提供有关物质对照品，保证安全性和质量。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Varian SD-1制备液相仪及色谱柱装填系统、色谱柱L&L4001（2.5 cm×25 cm）和L&L4002（5 cm×25 cm）、色谱散装填料PLRP-S（10 ?m，10 nm，美国Varian公司）；色谱散装填料ODS-AQ（5 ?m，12 nm，日本YMC公司）；Waters 2695/2489高效液相色谱仪（美国waters公司），Waters micromass ZQ单重四级杆质谱仪（美国Waters公司）；Agilent Extend C18分析柱（4.6 mm×150 mm， 5 ?m，美国Agilent公司）；冷冻干燥机（上海东富龙科技股份有限责任公司）；400 M核磁共振波谱仪（NMR AvanceⅢ 400 MHz，瑞士Bruker公司）。

STS原料和纯化水（上海第一生化药业有限公司）；甲醇和三乙胺（TEA，色谱纯，美国Tedia公司）；其他常规试剂为国产分析纯。

1.2 STS原料处理

取STS 10.1 g，配制成10 g/L水溶液，取 1 L 溶液置于烧瓶中 于100 ℃ 加热回流22 h，热降解产物溶液经三层滤纸过滤除去析出的固体沉淀，用0.45 ?m纤维素微孔滤膜进行过滤澄清，滤液经制备液相分离、纯化。

1.3 色谱条件

1.3.1 分析型HPLC条件

流动相：A为0.1%TEA水溶液，B为0.1%TEA甲醇溶液。以流动相A与B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0 min：90%A+10%B5 min：80%A+20%B10 min：65%A+35%B25 min：50%A+50%B30 min：90%A+10%B。柱温25 ℃，流速为1 ml/min，检测波长为271 nm，进样量20 ?l。

1.3.2 制备型HPLC纯化条件

滤液加10%甲醇后上样1 L，流速为100 ml/min，以流动相A与B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0 min：80%A+20%B10 min：80%A+20%B70 min：20%A+80%B，其余条件同 1.3.1。根据紫外检测结果按峰收集样品，对富集得到的组分A和B，用纯水稀释1倍后用相同条件再进行纯化，根据紫外检测结果按峰收集样品，得到组分A和B的纯化液。

1.3.3 制备型HPLC精制条件

对纯化得到的组分A和B纯化液用纯水稀释1倍后上样500 ml，流速为25 ml/min，以流动相A与B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0 min：80%A+20%B10 min：80%A+20%B50 min：40%A+60%B，其余条件同 1.3.1。根据紫外检测结果按峰收集样品，对收集组分没达到目标纯度的样品进行再次精制纯化，直至得到STS降解产物组分A和B的精制纯品。

2 结果与讨论

2.1 STS降解产物的HPLC分析

分析型HPLC检测STS原料加热前后的纯度变化，起始原料STS（保留时间21.95 min）纯度为96.57%，最大单杂纯度为1.6% （图1）；热降解后STS（保留时间21.20 min）纯度变为46.93%，产生两种主要的降解产物组分A （保留时间12.74 min）和B（保留时间18.65 min），纯度分别为17.68% 和18.41% （图2）。

1.3.3所获纯品溶液经50 ℃减压浓缩并冻干，得组分A 99.0 mg（无定形红棕色粉末，HPLC纯度为97.38%，保留时间12.68 min，图3）、组分B 95.0 mg（无定形红棕色粉末，HPLC纯度为95.34%，保留时间19.08 min，图4）。

2.2 质谱鉴定

质谱离子源为电喷雾离子源（ESI），负离子扫描模式检测，毛细管电压为3.0 kV，离子源温度为100 ℃，雾化气温度为350 ℃，雾化气流量为600.0 L・h-1，碰撞电压分别为4.0 eV（MS） 和15.0～30.0 eV（MS/MS），扫描范围m/z 100～2 000。对STS降解产物组分A和B纯品进行测定。质谱测得组分A分子离子峰[M-Na]-质荷比（m/z）为389.33，推测其为分子式可能为C19H17O7SNa（符合其理论相对分子量为412.39）；质谱测得组分B分子离子峰质荷比（m/z）为371.26，推测其分子式可能为C19H15O6SNa（符合其理论相对分子量394.05）。

2.3 核磁共振鉴定

STS降解产物组分A和B纯品各20 mg用D2O溶解后，进行1H NMR和13C NMR分析（表1），碳编号和结构见图5，最终经解析确证组分A的结构为1-羟基丹参酮ⅡA磺酸钠，组分B的结构为1，2-脱氢丹参酮ⅡA磺酸钠。

3 结论

本研究对STS原料进行高温强制降解并分离纯化后获得两个组分A和B，其可能的降解途径为STS氧化生成1-羟基丹参酮ⅡA磺酸钠（组分A），随后脱水生成1，2-脱氢丹参酮ⅡA磺酸钠（组分B）。温度为影响STS药物稳定性的关键因素，STS制备工艺中丹参酮IIA磺化反应及可能的氧化反应对产品质量影响至关重要；而STS制剂采用高压蒸汽灭菌，也可能会产生降解反应。研究表明，1-羟基丹参酮ⅡA磺酸钠和1，2-脱氢丹参酮ⅡA磺酸钠为STS最主要的两个降解产物。本文研究的方法能便捷、规模化地制备高纯度的这两个样品，可为质量控制提供对照品。

致谢 感谢张江药谷公共服务平台在MS测定中提供的帮助；感谢上海交通大学分析测试中心吴节莉老师在NMR测定中提供的帮助。

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（收稿日期：2014-03-27）