超声辅助VEGF165转染骨髓间充质干细胞的实验研究

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作者：汪涛　季军　周文　凌庆

【关键词】 超声

摘要：目的：探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法：采用超声辅助电穿法，将vegf165基因的质粒PEGFP-C1转染至骨髓间充质干细胞，转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达情况。结果：超声辅助转染5h后可见细胞内有GFP表达，10h后可达高峰。结论：VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞内有GFP表达，提示细胞转染成功，骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。

关键词：血管内皮生长因子；间充质干细胞；绿色荧光蛋白；转染

Experimental Study on VEGF165 Transfection of Medulla MSCs by Ultrasound

Abstract： Objective:To study the feasibility of medulla MSCs differentiation directionally to endothelial cells. Method:Observe the expression of green fluorescence protein(GFP) in medulla MSCs after transfection of VEGF165 vector,PEGFP-C1 by ultrasound under the fluorescence microscope.Result:GFP expression was seen 5 hours after transfection,and reached the peak 10 hours later.Conclusion: It is possible that medulla MSCs could be differentiate directionally to endothelial cells after the transfection of VEGF vector.

Key words:VEGF；Mesenchymal stemcells；GFP；Transfection

缺血性心脏病是冠状动脉狭窄或闭塞导致的心肌缺血从而影响心脏功能的一类疾病。随着组织工程学的发展，构建组织工程化血管内皮细胞可以为血管内皮损伤的临床修复提供一个新途径。间充质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）是一种分化程度低，具有多向分化潜能的成体干细胞。血管内皮生长因子（VEGF）是新近发现的血管内皮特异性生长因子，是一类分子量为34～45KD的糖蛋白。因此，VEGF有可能诱导MSCs定向分化为血管内皮细胞。本实验用携有VEGF基因的质粒PEGFP-C1，采用超声辅助电穿法转染MSCs。

1 材料与方法

1．1 材料：家狗骨髓MSCs由本实验室分离，大肠杆菌KH5X由第一军医大学临床解剖研究所提供，超声治疗仪US-700。

1．2 氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞：直接蘸取大肠杆菌DH5X，在无菌琼脂板表面划线，于37℃培养16h。挑一单菌落加入50ml AMP-LB培养基中，37℃200r/min振摇培养过夜。取50ul菌液加5ml培养基，37℃、200r/min振摇2～4h。在无菌条件下将细菌转移至无菌预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。与4℃以4000r/min离心10min，以加收细胞。倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞沉淀，在4℃下存放备用。

1．3 菌轻轻混匀，冰上放置30min，42℃水浴90s使细胞热休克，立即放回冰上，2min后加入45ul室温状态的LB培养基，37摄氏度、200r/min摇菌1.5h，1000r/min离心10min，100ul LB培养基重悬菌液，涂于AMP+的LB板上，37℃培养过夜，挑取1个阳性克隆，37℃摇菌12h。鉴定：取1ml菌液，用小量质粒提取试剂盒提取质粒。VEGF165基因插在PEGFP-C1质粒的HINDⅢ和EVORI之间的多克隆位点。取少量的质粒，HINDⅢ和EVORI双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1．4 PEGFP-VEGF165转染MSCS将0.5ml的添加液加至2.25ml细胞转染液中，混匀，孵育至室温备用。消化传代培养的MSCs，1000r/min离心10min，弃上清，尽量吸干残留培养液。用100ul细胞转染液重悬细胞，细胞的终浓度为4×105/ul。将细胞悬液与2ug质粒混匀。将超声治疗仪（S-700型，日本）调整强度为0.5W/cm2，频率为1kHz，连续性波刺激20min。每个反应体系中含有4×105/ulMSCs、2ug质粒和100ul细胞转染液。转染结束后，立即将细胞用专用的塑料吸管移至6孔培养板内，每孔加入2ml MSCGM完全培养基，37℃、5%CO2、95%湿度常规培养，并在倒置荧光显微镜下动态观察绿色荧光蛋白的表达情况。

2 结果

2．1 质粒的鉴定：质粒酶切后，1%琼脂凝胶电泳显示在5000BP和1000BP附近出现了两条带，分别为质粒（4.7KD）和目的基因片断（926BP）。纯化后的质粒浓度为150ng/ul，OD260/OD280为1.988。

2．2 MSCs的绿色荧光蛋白表达转染后5h可见细胞内有GFP表达，10h后达高峰。可持续3d左右，基于有些细胞荧光开始减退。

3 讨论

MSCs是中胚层来源的具有多向分化潜能的成体干细胞。这些细胞也存在于出生后的全身结缔组织的器官间质中，其中骨髓组织中含量最为丰富。MSCs不但能保持自我更新，而且还具有多向分化潜能［1］。可以向内胚层组织分化，形成血管内皮细胞和肝卵圆细胞。为此，利用VEGF165蛋白诱导MSCs定向分化为血管内皮细胞［2］。为血管内皮组织工程提供大量的种子细胞是一个很有前景的方法。

超声波应用于医学领域已有30多年的历史，主要分为两大类即诊断性超声和治疗性超声。治疗性超声常用于组织深部加热、缓解局部疼痛和促进炎症吸收等方面。近年来越来越多的研究显示，它可控制药物的释放，增强药物的靶向性，因而被用于药物的透皮吸收、溶栓药物和抗癌药物的靶向治疗以及转基因治疗等方面。转基因的目的是将外源性基因片段（主要是DNA）通过一定手段使其进入细胞或组织从而改变其基因表达而发挥功效。目前，常用的转基因方法有病毒携带、脂质体介导和电穿孔等方法。前者转导效率高但易发生插入畸变或导致病毒感染；脂质体方法比较安全但转导率较低；电穿孔直接但易造成细胞急性死亡。因此，急需寻找一种安全、高效的非病毒转基因方法。治疗性超声在一定的波长和强度下具有增加血管和细胞膜的通透性，尤其是有利于全身用药和转基因时药物在局部组织细胞的靶向定位，增强在局部的作用。体外和体内实验显示，与对照组相比转基因效率显著增高［3～5］。本实验结果表明：超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达，10h后出现表达高峰，可持续3d左右。相比较没有用超声辅助下可提前1～2h转染成功。同时也提示了利用基因转染技术诱导MSCs定向分化是可行的。

参考文献：

［1］Prockop DJ. Martin R, Rivans IH, et al. Marrow stromal cells stem cells for nonhematopoietic tissues［J］. Science ,1997,276(5309):71.

［2］Pittenger MF,Watkin NA, Morris SB, et al. Mutipotent ofhuman mesenchymal stem cells［J］.Science,1999,284(5411):143．

［3］Newman CM, Brisken AF, Cumberland DC, et al.Ultrasound geng therapy:on the road from concept to reality［J］.Echocardiography，2001,18(4):339-347．

［4］Porter TR, Xie F. Theraputic ultrasound for gene delivery［J］. Echocardiography，2001,18(4):349-353．

［5］Unger EC, Hersh E, Vannan M, et al. Gene delivery using ultrasound contrast agents［J］. Echocardiography，2001,18(4):355-361．