正交设计法优选穿山龙总皂苷的提取工艺

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【摘要】目的:确定穿山龙的最佳提取工艺。方法:采用正交试验设计进行条件优选,通过分光光度法对提取物进行总皂苷含量的测定。结果:优选提取工艺为:穿山龙饮片,加50%乙醇提取,提取次数为三次,每次提取时间为1.5h。结论:优选出的提取工艺较稳定,重现性好,可为生产实践提供理论依据。

【关键词】穿山龙;总皂苷;提取工艺;正交试验

doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.05.240文章编号:1006-1959(2010)-05-1247-02

【Abstract】Objective:To determine the best extract craft of Dioscorea nipponica.Methods:Orthogonal experiment was used to optimize the condition,the content of con-saponin was determined by spectrophotometric method.Results:The optimized extract craft was:crude drug of Dioscorea nipponica was extracted by 50% alcohol for three times,each time for 1 hour.Conclusions:The optimized extract craft was stable with good reproducibility,which could do a lot for production from the theoretical point.

【Key words】Dioscorea nipponica;Con-saponin;Extraction craft;Orthogonal experiment

穿山龙为2010版《药典》收录药材,为薯蓣科薯蓣属多年生藤本植物穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica Makino)的干燥根茎[1],气微,味苦涩,性温。具有祛风止痛,舒筋活血,止咳化痰的功效。临床上用于风湿痛,风湿关节痛,筋骨麻木,大骨节病,跌打损伤,咳嗽喘息、气管炎等疾病的治疗[2]。现代药理研究证明,其总皂苷类成分具有调节免疫,改善心血管功能,祛痰,抗肿瘤,抗炎镇痛等多种药理作用[3]。因而确定提取总皂苷的合理化工艺能为工业化生产该类药物提供技术支持。本文用正交试验方法对其提取工艺进行优化,确定其最佳工艺参数。

1.仪器与试药

1.1 仪器:分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)、旋涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)、KQ-50B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药:穿山龙药材,购于哈市人民同泰药店,经鉴定为薯蓣科薯蓣属多年生藤本植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的根茎、原薯蓣皂苷购于中国药品生物制品检定所(批号1539-200601)、其他试剂均为分析纯。

2.方法与结果

2.1 标准曲线的制备。

2.1.1 对照品溶液的配制。精密称取原薯蓣皂苷6.2mg,置10ml容量瓶中,加75%乙醇至刻度,超声30min,摇匀备用。

2.1.2 供试品溶液的配制。取0.0110g的药材提取物干粉,精密称定,置50ml量瓶中加,75%乙醇至刻度,超声30min,摇匀备用。

2.1.3 测定条件的选择。分别精密吸取供试品溶液0.2ml和对照品溶液0.5ml,置10ml具筛试管中,挥尽溶剂,分别精密加入高氯酸5ml,于65℃水浴中加热15min后,冰水冷却,在210-700nm处进行全波长扫描,结果在407nm处有最大吸收。

2.1.4 标准曲线的制备。分别取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml对照品溶液,于10ml具塞锥形瓶中,挥尽溶剂,分别精密加入5ml高氯酸,置旋涡混合器振摇5min,65℃水浴中加热15min后,冰水冷却,407nm处测定吸光度,绘制标准曲线,曲线方程为y=0.249x+0.0033,r=0.9995,说明总皂苷在0.062-0.372mg有良好的线性关系。

2.1.5 稳定性试验。取样品溶液以上方法显色处理后,在不同时间每隔10min测定其吸光度值,结果表明样品在2h内是稳定的。

2.2 提取工艺优选。

2.2.1 因素水平的选择。采用L9(34)正交试验设计,用加热回流法确定出其最佳提取工艺。设计方法如(表1所示):

表1 四素三水平设计表

水平A乙醇浓度(%)B溶剂量(倍)C提取次数D提取时间(h)

10611

230821.5

3501032

2.2.2 正交试验结果与方差分析。取样品每份150g,按照L9(34)正交试验设计表安排实验,得到九次实验的提取液,烘干,分别制成干粉21.0g、34.0g、41.2g、32.0g、33.5g、24.6g、34.0g、27.2g、30.1g,各精密称定干粉0.0117g、0.0102g、0.0106g、0.0112g、0.0104g、0.0111g、0.0108g、0.0113g、0.0123g置50ml容量瓶中,加75%乙醇至刻度,超声30min,摇匀备用。各精密量取0.2ml样品,分别置于10ml试管中,于水浴上挥干,分别精密加入5ml高氯酸,涡旋5min,65℃水浴中加热15min后,冰水冷却,于407nm处测定吸光度。得到数据如下,其正交试验结果与方差分析如(表2、表3所示):

表2 L9(34)正交实验设计及结果

实验号ABCD总皂苷含量(g)

111119.2

2122214.7

3133316.7

4212315.4

5223121.9

6231215.1

7313223.6

8321316.3

9332118.3

均值113.516.113.516.5

均值217.517.616.117.8

均值319.416.720.716.1

极差5.91.67.21.7

优水平A3B2C3D2

表3 方差分析

差异来源离差平均和自由度均方F值显著性

A54.42227.2122.49

B(误差)2.4221.21

C69.69234.8528.8

D4.7422.371.96

F(2,2)0.05=19,F(2,2)0.01=99。

3.结果与分析

3.1 由(表2)直观分析可知,RC>RA>RD>RB,4个影响总皂苷得率的因素的主次顺序,分别是C>A>D>B,即提取次数>提取浓度>提取时间>溶剂量,最佳工艺参数为A3B2C3D2,即以乙醇浓度为50%,提取溶剂量为6倍量,提取次数三次,提取1.5h的条件提取,薯蓣总皂苷得率最高。

3.2 (表3)是方差分析的结果,由F值可知,各因素对实验结果影响结果的程度是C>A>D>B,即影响最大的是提取次数,其次是提取浓度,然后是提取时间、溶剂量。因素C和A有显著性差异,与上面结果分析一致。

4.结论

以总皂苷得率为考察指标,采用正交设计法,对穿山龙总皂苷进行提取工艺进行优选,得出最佳提取工艺为:穿山龙饮片,加50%乙醇6倍量提取,提取次数为三次,提取时间为1.5h。

5.讨论

5.1 供试液的制备过程中,对其超声提取时间(30min、60min、90min)和显色剂加热时间(10min、15min、20min)进行了考察,最后确定超声时间为30min,显色剂加热时间为15min。

5.2 穿山龙的有效成分主要为甾体皂苷类,包括薯蓣皂苷(Dioscin)、纤细皂苷(Gracillin)和水溶性皂苷[4,5]。总皂苷水解产生薯蓣皂苷元(Diosgenin)。有关薯蓣皂苷元含量测定方法的文献较多,但研究穿山龙总皂苷含量测定的文献较少。本论文采用分光光度法对穿山龙总皂苷的含量进行测定,方法简便、可行,为穿山龙总皂苷的测定方法提供了新手段。

参考文献

[1] 中华人民共和国药典.2010年版一部:250.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典(下册).上海:上海人民出版社,1977:1726.

[3] 王晓鹏,陆羡.薯蓣皂苷生物活性研究新进展[J].国外医学中医中药分册,2004,26(3):138-140.

[4] 方一苇,赵家俊,贺玉珍,等.穿龙薯蓣中两种水难溶性甾体皂甙的结构研究.药学学报,1982,17(5):388.

[5] 李永茂,何宝俊,刘振庸,等.穿山龙水溶性有效成分的研究.中国医科大学学报,1979,(4):14.