桦褐孔菌原生质体制备与再生
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇桦褐孔菌原生质体制备与再生范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘 要：采用正交设计方法对桦褐孔菌原生质体最佳制备与再生条件从酶条件、酶解时间、温度等5个方面进行了研究。试验结果表明：其原生质体制备最佳条件是以液体静置培养6 d的菌丝体，0.6 mol・L-1 KCl作为渗透压稳定剂，在30 g・L-1 溶壁酶作用下，32 ℃酶解4 h，制备率达2.675×107个・mL-1；再生最佳条件是液体静置培养10 d的菌丝体，0.6 mol・L-1 NaCl为渗透压稳定剂，在30 g・L-1溶壁酶作用下，32 ℃酶解2 h，再生率为6.83%。
关键词： 桦褐孔菌；原生质体；制备率；再生率；正交设计法
中图分类号：S646.9 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.06.003
Protoplast Preparation and Regeneration of Inonotus obliquus
LI Jun, GUO Cheng-jin
(College of Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300387,China)
Abstract: The influence of enzyme system, enzymolysis time, temperature, mycelial age and osmotic pressure stabilizer on the preparation and regeneration of Inonotus obliquus protoplasts were studied by orthogonal design.Orthogonal analysis showed that the highest protoplast product (2.675×107 ・mL-1) was obtained from 6-day-old mycelium, digested by 30 g・L-1 lywallzyme for 4 hours at 32 ℃, using 0.6 mol・L-1 as osmotic pressure stabilizer. Protoplasts produced in the condition that 10-day-old mycelium, at 32 ℃ by 0.6 mol・L-1NaCl,30 g・L-1 Lywallzyme digesting 2 hours were optimal to regeneration. The regeneration rate was 6.83%.
Key words: Inonotus obliquus; protoplast；preparating rate; regenerating rate; orthogonal design
桦褐孔菌[Inonotus obliquus (Fr.) Pilat]隶属于真菌界、担子菌门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、卧孔菌属。它富含β-D-葡聚糖，其含量是红樟菌的30倍；SOD含量是红樟菌的23倍，是灵芝的55倍。长期的动物实验及临床实验表明：桦褐孔菌无毒副作用，主要作用有抗癌、预防艾滋病、治疗糖尿病、抗衰老、增强免疫力等[1]。笔者较系统研究了桦褐孔菌原生质体的制备和再生条件，为今后对桦褐孔菌原生质技术工作提供有益支持。
1973年，Devriers等[2]对裂褶菌原生质体发育研究成功，将原生质体融合技术运用到蕈菌研究领域。原生质体技术已作为研究蕈菌生理、生化、遗传等基础理论和改良菌种的一种重要方法和有效手段。采用原生质体技术进行真菌良种选育的研究已有许多成功报道，但就桦褐孔菌原生质体育种研究而言，至今鲜见报道。笔者利用正交设计方法对桦褐孔菌原生质体制备与再生的条件进行探讨。
1 材料和方法
1.1 材 料
桦褐孔菌[Inonotus obliquus (Fr.) Pilat]由天津师范大学蕈菌研究所提供。
试剂：葡萄糖，酵母粉，牛肉膏，MgSO4・7H2O，KH2PO4 ，KCl，NaCl，VB1 ，蔗糖，甘露醇；琼脂，溶壁酶，蜗牛酶，纤维素酶R-10。以上均为分析纯和生化试剂。
试验仪器：YXQG02手提式压力蒸汽消毒器，SW-CJ-2超净工作台，TGL-16G高速冷冻离心机，HH-S恒温水浴锅，Galen显微镜等。
固体斜面培养基：棉籽皮200 g・L-1和马铃薯200 g・L-1（浸提液）、葡萄糖20 g・L-1、KH2PO4 3 g・L-1、MgSO4・7H2O 1.5 g・L-1、VB10.04 g・L-1、琼脂20 g・L-1，pH值自然。
液体培养基：葡萄糖20 g・L-1、蔗糖20 g・L-1、酵母粉0.5 g・L-1、牛肉膏1 g・L-1、KH2PO4 3 g・L-1、MgSO4・7H2O 1.5 g・L-1，VB10.01 g・L-1，pH值自然。
再生培养基：液体培养基+琼脂6 g・L-1，以0.6 mol・L-1蔗糖配制，pH值 6.5。
再生对照培养基：液体培养基+琼脂6 g・L-1，以蒸馏水配制，pH 值6.5。
0.6 mol・L-1甘露醇、蔗糖、NaCl、KCl。
1.2 方 法
取生长旺盛的菌丝尖端接种于盛50 mL液体培养基的100 mL三角瓶中，25 ℃静置暗培养8～17 d。
按表1称取各种酶，用相应的渗透压稳定剂溶解制成酶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。
挑取表1中相应菌龄的菌丝体置于5 mL离心管中，用相应的渗稳剂离心洗涤3次，每次6 000 r・min-1离心10 min，弃上清液后无菌滤纸吸去多余水分。每100 mg湿菌丝体加1 mL酶液，置带有玻璃珠的5 mL离心管中匀碎菌丝体，在相应的条件下酶解。
酶解后，酶解液经0.18 mm无菌滤网过滤。滤液4 000 r・min-1离心10 min，弃上清液，用相应渗稳剂悬浮沉淀，再次离心，重复3次以彻底除去酶液。
沉淀物最终溶于适量渗透压稳定剂中，得纯化原生质体悬液。吸取少量悬液，用血球计数板在显微镜下观察并计数，计算原生质体得率。
用相应渗稳剂将原生质体悬液稀释至105 个・mL-1，分别吸取0.2 mL涂布在再生培养基上和再生对照培养基。25 ℃的恒温暗培养箱中培养7～50 d，记录再生菌落生长情况，计算原生质体再生率。
采用L16(45)正交设计法，从酶种类、渗稳剂、酶解温度等5个因素进行正交设计，从而确定桦褐孔菌原生质体制备与再生的最佳条件。正交试验设计如表1所示。
2 结果与分析
2.1 各因素对原生质体制备的影响
极差越大，该因素对试验结果的影响越大。据表2对酶条件、酶解时间、温度等5个因素的极差进行比较，可见温度的极差最大，即桦褐孔菌原生质体制备率的重要影响因素是温度，其次是酶条件、酶解时间、菌龄、渗稳剂。
K值大是较好的试验条件，由表2可知，桦褐孔菌原生质体制备最佳体系为液体静置培养6 d的菌丝体，0.6 mol・L-1 KCl作为渗透压稳定剂，在30 g・L-1溶壁酶作用下，32 ℃酶解4 h。此制备体系经3次重复试验，桦褐孔菌原生质体制备率较稳定，可达2.675×107 个・mL-1 。
通过观察，发现桦褐孔菌原生质体释放方式有4种，即端位释放、侧位释放、菌丝段端位释放和原位释放。
2.1.1 酶条件对原生质体得率的影响 蕈菌细胞壁成分较为复杂。溶壁酶是一种复合酶，试验表明，溶壁酶的酶解对象与桦褐孔菌细胞壁成分基本一致，利于菌丝细胞破壁释放原生质体。故此桦褐孔菌原生质体制备最佳酶组合为30 g・L-1溶壁酶。
2.1.2 渗稳剂对原生质体得率的影响 渗稳剂的性质影响着酶的活性，不同酶系统只有与其体系的渗稳剂匹配才能得到最佳酶解效果。
试验分别以0.6 mol・L-1的蔗糖、甘露醇、KCl和NaCl作为渗透压稳定剂，结果如表2所示，以0.6 mol・L-1的KCl作为渗稳剂时，原生质体制备率最高，其余依次为NaCl、甘露醇、蔗糖。
2.1.3 酶解时间对原生质体得率的影响 酶解初期，原生质体由菌丝顶端释放，随着酶解时间的延长，菌丝逐渐断裂[3-4]，由开始的顶端释放变为其他释放方式。随时间推移，其原生质体释放出现峰值，随后原生质体易破裂，得率下降。由表2可知，酶解4 h时桦褐孔菌原生质体制备率达到最高值。
2.1.4 酶解温度对原生质体得率的影响 随着酶解温度的提高，酶易失活，已经释放的原生质体被破坏；温度过低，酶活性低[5-6]，原生质体得率低。试验结果表明32 ℃时桦褐孔菌原生质体产量最高。
2.1.5 菌龄对原生质体得率的影响 菌丝快速生长期容易制备原生质体，可能是因为幼嫩菌丝细胞壁成分简单、壁薄，更易于被酶解[7-10]。以6 d菌龄桦褐孔菌菌丝体制备原生质体时产量最高，随着培养时间的延长，原生质体产量随之下降。
2.2 各因素对原生质体再生的影响
原生质体的再生，包括其细胞壁的再生、细胞结构和功能修复、细胞分裂，既表现为独立，又相互联系，是细胞自我修复的过程。
试验采用L16(45)正交设计法，对影响原生质体制备的5个因素进行了最佳再生试验条件研究。
比较表3对酶条件、酶解时间、温度等5个因素的极差，得知桦褐孔菌原生质体再生的首要影响因素是菌龄，其次是酶条件、温度、时间、渗稳剂。
比较表3中水平之间 K值大小可知，桦褐孔菌原生质体再生最佳制备体系为液体静置培养10 d的菌丝体，用0.6 mol・L-1 NaCl为渗透压稳定剂，在30 g・L-1溶壁酶作用下，32 ℃酶解2 h。此制备体系经3次验证，桦褐孔菌原生质体再生率较稳定，最高达6.83%。
2.2.1 酶条件对原生质体再生的影响 酶解壁过于彻底，细胞壁合成必从头开始，均会影响原生质体的再生[11-13]。
由表3可知，使用30 g・L-1的溶壁酶时，桦褐孔菌原生质体再生率最高。而加入纤维素酶和蜗牛酶的组合，可能是纤维素酶和蜗牛酶对原生质体造成一定伤害，影响原生质体的再生率。
2.2.2 渗稳剂对原生质体再生的影响 渗透压稳定剂既是裂解酶的作用环境，也是原生质体的活性环境。故此，其渗稳剂的选择，既考虑利于对原生质体稳定，又要兼顾利于细胞壁的形成和胞内各细胞器、超分子复合物功能修复以及适宜的养分。
2.2.3 酶解时间对原生质体再生的影响 由表3可知，酶解2 h 时，桦褐孔菌原生质体再生率最高，主要是酶解时间短，细胞壁破壁不完全，较易再生出细胞壁。
2.2.4 酶解温度对原生质体再生的影响 由表3知，32 ℃制备的原生质体再生率最高。低于32 ℃原生质体得率较少，再生率不高，随温度升高，再生率不断升高，32 ℃时达到峰值，之后随着温度升高再生率又有所下降，可能是由于温度升高原生质体稳定性下降所致。
2.2.5 菌龄对原生质体再生的影响 菌龄高的菌丝原生质体多为侧位释放，原生质体体积较大，一般都有核，比较易于再生。幼嫩菌丝虽较易破壁，但释放的原生质体体积较小，大都观察不到细胞核，易破裂，稳定性差。
据表2，桦褐孔菌菌丝体在10 d时再生率最高，主要是由于其细胞核、细胞器发育较完整，原生质体体积大，活性高，有利于其功能的修复。
3 讨论
笔者研究的渗稳剂对原生质体得率与再生的影响，结果表明，KCl作为渗稳剂时原生质体得率最高，NaCl作为渗稳剂时原生质体再生率最高。考虑到可能是无机渗稳剂对桦褐孔菌原生质体形态的维持和再生过程中细胞器的修复较有机渗稳剂好。图6为桦褐孔菌原生质体再生图片。
4 结论
桦褐孔菌原生质体制备最佳体系为液体静置培养6 d的菌丝体，0.6 mol・L-1 KCl作为渗透压稳定剂，在30 g・L-1溶壁酶作用下，32 ℃酶解4 h，制备率达2.675×107 个・mL-1。再生的最佳条件是液体静置培养10 d的菌丝体，用0.6 mol・L-1 NaCl为渗透压稳定剂，在30 g・L-1溶壁酶作用下，32 ℃酶解2 h，再生率为6.83%。
酶类、酶解时间、温度、菌龄、渗稳剂各因素对原生质体产量和再生率的影响并不相同，应统筹考虑，原生质体的活性高才是决定其再生的决定性因素。
参考文献:
[1] 高雪丽, 高愿军, 吴广辉. 桦褐孔菌功能特性的研究进展[J]. 食品与机械, 2006,22(5):126-131.
[2] Wessels D G.Wall structure , wall degradation , protoplast liberation and wall regeneration in Schizophyllum commune [C]. Yeast mould and plant protoplasts. London: Academic press , 1973：295-306.
[3] 孙溪, 郭成金. 双孢蘑菇原生质体制备条件的优化[J].天津师范大学学报:自然科学版,2006,26(4):32-35.
[4] 朱建勇, 胡凯, 胡力涛, 等. 产紫杉醇内生真菌XT5原生质体制备与再生[J].西南大学学报:自然科学版, 2008,30(5):90-93.
[5] 彭浩, 邓百万, 陈文强, 等. 猪苓原生质体制备及细胞再生研究[J]. 江苏农业科学,2008(3):167-169.
[6] 勾丽莉, 李莉, 周建树, 等. 血红铆钉菇原生质体制备条件优化的研究[J].食用菌, 2008(4)：19-21.
[7] Peberdy J F. Microbial and plant protoplasts[M]. London: Academic Press, 1976：39-50．
[8] 杨凤苓,贾乐,任轩. 姬菇原生质体制备与再生条件初探[J].生物技术, 2007,17(6):37-40.
[9] 金卫根, 孙丽萍. 茶薪菇原生质体制备条件的分析[J].菌物研究, 2009, 4(4)：65-68.
[10] 陈宏伟, 陈安徽, 王陶, 等. 蛹虫草无性型原生质体制备条件的研究[J]. 徐州工程学院学报:自然科学版, 2008,23(14)：22-26.
[11] 李楠, 许修宏. 黑木耳原生质体制备及再生的研究[J].东北农业大学学报, 2009, 40(7)：34-37.
[12] Cheng Y L, Belanger R R. Protoplast preparation and regeneration from spores of the biocontrol fungus pseudozyma focculosa[J]. FEMS Microbiology Letters,2000, 190：287-291.
[13] 刘玉霞, 王谦, 陈瑞玲, 等.白灵菇原生质体制备及再生的研究[J]. 食用菌, 2009(4):24-25.