桦褐孔多糖提取研讨
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桦褐孔菌(Inonotusobliquus)属多孔菌科(Polyporaceae)、褐卧孔菌属(Inonotus)，是十分珍贵的药用真菌［1］。桦褐孔菌主要分布于寒冷的俄罗斯、北欧、波兰、日本北海道等地，中国黑龙江大小兴安岭和吉林长白山地区［2］。早在16～17世纪，俄罗斯、波兰、芬兰等民间就将桦褐孔菌做保健功能性食品利用［3－5］。桦褐孔菌的药效已被证明具有治疗各种消化系统癌症、心脏病、糖尿病［6，7］，具有抗衰老和抑制HIV－1病毒的作用［8］，已引起美国、日本、韩国等国研究者的广泛重视［9，10］。我国对桦褐孔菌活性成分研究目前已报道的有:桦褐孔菌素，桦褐孔菌醇和多种氧化三萜类化合物，多种羊毛甾醇型三萜类化合物等，但研究应用较多的为桦褐孔菌多糖成分。桦褐孔菌多糖是中药多糖的一种，无毒副作用，可预防和治疗多种疾病，具有抗肿瘤、降血糖、增强免疫力、防治病毒性传染病的功效，多糖的研究已经引起国内外广大药物研究开发者的重视［11－13］。多糖提取的方法很多，本研究对影响桦褐孔菌子实体水溶胞内多糖提取效果的各个因素进行了研究，单因素法筛选对多糖提取影响大的因子，正交试验优化提取条件，目的是建立一套能最大限度地提取桦褐孔菌胞内多糖的可行性工艺，研究结果如下。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料野生桦褐孔菌野生子实体采自吉林省长白山地区。
1.1.2试剂乙醇、氯仿、异戊醇、3，5－二硝基水杨酸、苯酚、硫酸，以上试剂为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1原材料的前期处理野生桦褐孔菌子实体烘干粉碎，过120目筛，于60℃烘箱至恒重，作为实验原材料。
1.2.2单因素试验在其它浸提条件一致的情况下，分别选择不同时间(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h)、不同温度(60、70、80、90、100℃)、不同料水比(1:20、1:30、1:40、1:50、1:60)、不同提取次数(1次、2次、3次)、不同醇沉浓度(60%、70%、80%、90%)和不同醇沉温度(4、25℃)进行胞内多糖提取，并测定多糖收率。
1.2.3提取方法精确称取桦褐孔菌菌粉lg，根据实验要求加入1:40体积料水比的蒸馏水，于100℃温度下煮2.0h，提取2次，合并提取液，4℃、10000r/min离心15min，取上清，水浴蒸发浓缩至原体积的1/3，加终浓度为80%的无水乙醇，4℃静置12h，10000r/min离心15min，收集沉淀，60℃烘干至恒重，即得粗多糖。
1.2.4还原糖含量测定以葡萄糖为标准品，还原糖含量用DNS法测定。
1.2.5多糖含量测定总糖含量测定采用苯酚－硫酸法。多糖含量=总糖含量－还原糖含量。
1.2.6粗多糖提取率和多糖收率的计算提取率(mg/g)=提取粗多糖(mg)/提取物干重(g);多糖收率(%)=多糖含量(%)×多糖提取率。
1.2.7热水浸提法正交试验设计以桦褐孔菌多糖收率为指标，选用L9(33)正交表，以浸提温度、浸提时间、料水比为基本因素，设计正交试验，因素水平见表1。
1.2.8数据统计分析DPSv7.05统计软件进行Duncan新复极差方差分析与显著性测验。
2结果与分析
2.1温度对胞内多糖收率、提取率的影响温度对提取的效果影响很大，结果见图1。随着温度的升高胞内多糖的提取率和多糖收率快速升高。当温度达80℃时其粗多糖提取率最大，为127mg/g，较60℃时提高了73.50%，多糖收率也达2.32%。温度超过80℃以上时，胞内多糖的提取率和收率平缓下降。
2.2时间对胞内多糖收率、提取率的影响时间对胞内多糖提取效果的影响见图2，粗多糖提取率随提取时间的延长逐渐升高。2.5h多糖收率达到最高，为2.09%。2.5h以上时，胞内多糖的收率下降并趋于平稳，而多糖提取率升高也趋缓。
2.3料水比对胞内多糖收率、提取率的影响料水比对提取效果的影响见图3，当料水比从1:20增加至1:40时，胞内多糖提取率、多糖收率达到最高水平，再增加料水比，多糖提取率和收率反而有所下降，尤其是多糖的收率下降较显著。
2.4醇沉浓度对多糖收率、提取率的影响不同乙醇浓度沉淀提取多糖结果见图4，随着混合液醇浓度的增加多糖提取率、收率也随之增加，醇浓度达80%时，胞内多糖提取率和多糖收率达到最高，再增加乙醇浓度多糖收率、提取率呈下降趋势。
2.5提取次数对胞内多糖提取率的影响从表2可知，前两次胞内多糖提取率较大，占总提取量的98.77%，第3次的提取率很低，因此，2次提取为适宜的提取次数。
2.6醇沉温度对多糖提取率的影响表3比较了25℃和4℃乙醇沉淀多糖的效果。在4℃条件下醇沉效果明显好于25℃，4℃乙醇沉淀提取率较25℃时提高了近20%。2.7桦褐孔菌胞内多糖收率的正交试验实验结果见表4，处理5多糖收率最高达2.53%。各处理差异显著性分析表明，5%水平除1、3处理外，各处理差异较显著。1%处理5、6、8、9较其他处理差异极显著。表4L9(33)正交实验结果及差异显著性方差分析结果见表5，料水比、提取温度对不同桦褐孔菌菌丝多糖提取率在1%、5%水平有极显著影响，提取时间在5%水平有显著影响。正交实验的极差分析可知(表5)，各因素对胞内多糖提取率影响的顺序为:A＞B＞C，影响最大的是A料水比，最小的是C提取时间。表6可知，胞内多糖提取条件的最优组合为A2B2C1，即料水比为1:40，温度80℃，提取时间1.5h。表5正交实验方差分析.
3讨论
桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌含有的重要生物活性物质，具有清除自由基和免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等活性。桦褐孔菌多糖的提取、纯化、分离的研究就显得尤为重要。近年来开展的研究较多，方法多样［14，15］，但研究较多的方法目前以热水浸提法最为常见。本研究采用热水浸提法，就影响水提多糖的若干因素进行单因素和正交优化实验。浸提过程中料水比影响最大，其次是温度和浸提时间。本研究选择了料水比为1:40，此时胞内多糖提取率、多糖收率达到最大，再增加料水比对多糖提取无提高，同时也增加了浓缩体积的困难。温度对提取效果影响也很大，80℃时多糖提取率、收率都达到较高水平，此温度即可节省能源，又对浸提设备要求不高，可满足实际操作的大规模生产需求。提取时间是影响胞内多糖提取效果的另一重要因素，时间太短，多糖不能完全提取出来。2.5h提取的多糖提取率、收率最高，但提取时间太长，能耗大、效率低。研究通过优化正交组合有效地克服了此项不足，采用1.5h的复合条件就实现较高的多糖收率。同时对影响较大的3个因子进行了L9(33)正交试验，对桦褐孔菌水提多糖的提取条件进行复合筛选，初步优化了桦褐孔菌子实体多糖的提取工艺，确定了提取多糖的最佳提取条件，使水溶性多糖收率高达2.53%，同时比常规提取法缩短了提取时间，降低了提取温度，提高了提取效率。本研究优化了多糖的提取条件，为进一步大规模生产提供技术参数。但有关桦褐孔菌多糖的纯化、结构、组分、生物活性的研究还有待进一步开展。