结直肠癌医学的小议
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目的 检测结直肠癌组织中E-钙粘素的表达及其淋巴结微转移，探讨两者间的关系。方法 以CK20 mRNA为标记物，应用RT-PCR对60例结直肠癌根治性手术切除的淋巴结标本共782例进行检测;免疫组化法(SP法)检测结直肠癌组织、癌旁组织、淋巴结微转移及正常对照组中E-钙粘素的表达。通过二者的综合分析，试图发现抑癌基因E-钙粘素在结直肠癌淋巴结微转移的生物学行为中的作用。结果 CK20法检出45例(75.0%)患者有淋巴结转移，阳性淋巴结总数为436个(55.8%);常规病理学检出34例(56.7%)患者有淋巴结转移，检出阳性淋巴结数为356个(45.5%);两组比较，差异具有统计学意义(χ2=16.72，P<0.05)。11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例(54.5%)E-Cadherin表达阴性，而15例未检出淋巴结微转移癌组织中仅有1例(6.67%)表达阴性，两者比较差异有统计学意义(χ2=4.160，P=0.041)。结论 E-Cadherin的表达减弱或消失参与了结直肠癌淋巴结微转移的发生。
结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。每年有10%的恶性肿瘤患者死于结直肠癌[1，2]。术后复发和转移是影响结直肠癌预后的最主要因素之一。在实施了根治性手术的结直肠癌患者中，仍有20%~50%的患者死于术后肿瘤的局部复发和转移[3，4]，有研究认为该现象与结直肠癌淋巴结微转移有关。E-Cadherin粘附分子介导细胞粘附的紊乱涉及肿瘤的发展和转移。E-Cadherin表达或功能的丧失与癌细胞丧失分化和较高的侵袭能力有关。本研究通过免疫组化方法检测E-Cadherin粘附分子在结直肠癌和转移灶的表达，以CK20为靶目标，应用RT-PCR法检测结直肠癌淋巴结的微小转移，以探讨结直肠癌浸润转移相关基因的表达与临床分期、浸润转移的关系。探讨结直肠癌组织中E-Cadherin的表达及其与淋巴结微转移的关系，试图对结直肠癌转移做出预测和早期诊断，为临床治疗提供依据和手段。
1、实验材料及方法
1.1 实验材料
1.1.1 病例与标本 收集我院2005~2007年散发性结直肠癌根治术后标本60例，其中男32例，女28例;年龄28~79，平均58.4岁。所有患者术前均未行放、化疗;剔除遗传性非息肉病性散发性结直肠癌和家族性腺瘤肉病。分化程度:高分化23例，中分化21例，低分化16例;淋巴结转移34例，无淋巴结转移26例;TNM分期I期6例，II期26例，III期22例，IV期6例。术中采集散发性结直肠癌患者肿瘤周围肿大淋巴结共782个，剖开，一半行常规术后病理，另一半保存于-80℃冰箱备用。选择远癌“正常”大肠黏膜组织(距癌灶>4 cm)和癌旁(距癌灶<2 cm)大肠黏膜组织各10例作为对照观察。所有标本经10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋。本研究得到医院伦理委员会批准，所有患者本人均签署知情同意书。
1.1.2 试剂 鼠抗人E-Cadherin单克隆抗体和S-P试剂盒(Zymed公司)。TRIzolReagent(Invitrogen公司)，TAKARA AMV逆转录试剂盒(Takara公司)，TAKARA LA Taq(Takara公司)，PCR试剂(Takara公司)，DNA分子量Marker(晶美公司)。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的抽提 采用标准TRIzol法(参照说明书)提取术后淋巴结标本的总RNA，凝胶电泳和分光光度计检测RNA浓度和纯度。
1.2.2 cDNA制备 总RNA样品1 μl，依次加入Oligo dT(18)0.5 μl，MgCl2 2 μl，10×RT Buffer 1 μl，RNase Free dH2O 3.75 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，RNase Inhibitor 0.25 μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl。总反应混合物于30℃反应10 min，42℃反应30 min，99℃反应5 min，5℃反应5 min。
1.2.3 引物的合成 在NCBI数据库中查找编码人类基因CK20的核酸序列，其登录号为NM_019010，该序列长1817 bp，编码序列CDS(Coding Sequence)位于43-1317 bp间。以此序列为基础，在CDS区内设计引物。上游引物5’-ACCTAAATGACCGTCTAGCGAGC-3’下游引物5’-CACATTGACAGTGTTGCCCAGAT-3’扩增片段为449 bp大小，引物由上海英俊公司合成。
1.2.4 PCR反应和分析 采用RT-PCR方法，以人结直肠癌淋巴结cDNA为模版.反应体系为50 μl:cDNA模版1 μl，10× LA PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 5 μl，20 pmol/μl 上游和下游引物各1 μl，10 mmol/L dNTP Mixture 2 μl，LATag酶0.5 μl，补去离子水至50 μl。PCR反应条件:94℃预变性3 min;94℃变性30 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环;72℃再延伸5 min。反应完毕后进行电泳分析。
1.2.5 结直肠癌组织切片厚4 μm，0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复，S-P免疫组化染色。染色步骤按说明书进行，DAB显色，苏木精复染胞核。PBS代替第1抗体作阴性对照。
1.3 统计学方法 资料的统计分析在SPSS13.0软件包中进行，数值变量以均数(95%可信区间)表示，计数资料用率来表示，两组间率的比较采用χ2检验法。并采用诊断性实验分析方法计算CK20与传统病理切片技术诊断结直肠癌淋巴结转移的准确度、敏感度和特异度。
实验结果:
图A E-Cadherin在正常大肠黏膜上皮细胞中的表达 40×
图B E-Cadherin在结直肠癌组织中的表达 40×
2、结果
2.1 60例散发性结直肠癌患者的782个受检淋巴结经常规病理学检查，34例(56.7%)患者有淋巴结转移，阳性淋巴结总数为356个(45.5%)。而采用RT-PCR法检测CK20 mRNA的表达情况来判断淋巴结转移，结果显示，45例(75.0%)患者有淋巴结转移，较病理学检查结果新增11例，差异具有统计学意义(χ2=4.483，P=0.034)。阳性淋巴结总数为436个(55.8%)，较病理学检查结果新增80个，差异具有统计学意义(χ2=16.371，P<0.001)。
2.2 E-
Cadherin表达与结直肠癌临床病理参数的关系 E-Cadherin在癌组织中的表达阳性率显着低于癌旁组织(P<0.05)。E-Cadherin低表达与结直肠癌Dukes分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝脏转移呈正相关(P<0.05)。
2.3 11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例E-Cadherin表达阴性，而15例未检出微转移癌组织中仅有1例表达阴性，两者差异有统计学意义(χ2=4.160，P=0.041)。 3 讨论
E-Cadherin又称细胞-细胞粘附分子，广泛分布于各类上皮细胞间介导同型细胞间连接的、具有钙依赖性的粘附分子，其在胚胎发育、形态发生、上皮极性和完整性等方面起到重要作用[5]。其表达程度及功能活性状态直接影响细胞的脱落和再粘着，对维持组织结构的完整性、极性及细胞分化等起重要作用[6]。其表达下降时细胞的粘附作用减弱，使肿瘤细胞发生浸润和转移[7]。
本研究表明，E-Cadherin在高分化型结直肠癌的表达明显高于未分化型的结直肠癌，提示E-Cadherin与肿瘤的分化有关，可作为分子标记物来鉴别肿瘤的恶性程度。本组资料显示E-Cadherin的异常表达与结直肠癌的病理组织类型无明显相关性，主要考虑与各型腺癌结构的分化和异型程度不一致造成，例如管状腺癌就包括高、中、低分化三种类型。
多数学者认为E-Cadherin是肿瘤浸润抑制基因[8，9]。文献报道，结直肠癌E-Cadherin表达异常与肿瘤分化及浸润深度密切相关，与本研究发现一致。可见E-Cadherin可以作为大肠癌的标志物，协助判断大肠癌的预后。
研究证明，淋巴结微转移与患者预后直接相关。CK20是一种独特的I型细胞角蛋白，为具有严格的上皮特异性的癌细胞标志物，可稳定地存在于几乎所有的胃肠道癌及其转移癌中，正常血液及淋巴结的固有成分如淋巴细胞、内皮细胞一般不表达，是检测直肠癌微转移较特异的指标[10，11]。我们应用RT-PCR检测CK-20阳性率为(55.8%)，而传统病理切片诊断为淋巴结转移的阳性率为(45.5%)，两组间有显着性差异(P<0.001)。
11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例(54.5%)E-Cadherin表达阴性，而15例未检出微转移癌组织中仅有1例(6.67%)表达阴性，两者差异有统计学意义(P=0.041)。本研究提示E-Cadherin的表达减弱或消失参与了结直肠癌淋巴结微转移的发生。