不同浓度嗜酸乳酸杆菌对急性期实验性结肠炎肠黏膜屏障的研究
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摘要：目的 研究不同浓度嗜酸乳酸杆菌对急性期溃疡性结肠炎模型小鼠肠黏膜屏障的作用。方法 50只小鼠随机分为正常对照组、模型组、不同浓度嗜酸乳酸杆菌组，对小鼠进行急性期溃疡性结肠炎动物模型建立；观察小鼠一般情况，体重变化，粪便隐血及结肠病理表现，免疫组织化学荧光染色测定结肠组织zo-1、occludin紧密连接蛋白的变化。结果 不同浓度嗜酸乳酸杆菌治疗模型小鼠的一般情况及病理组织学均有明显改变，与模型组比较，不同浓度嗜酸乳酸杆菌组结肠组织zo-1、occludin蛋白表达增加，但1×106CFU/ ml浓度嗜酸乳酸杆菌组蛋白较其他浓度组zo-1、occludin蛋白表达显著增加。结论 可见1×106CFU/ ml浓度嗜酸乳酸杆菌对急性期溃疡性结肠炎模型小鼠肠黏膜屏障有调节作用。
关键词：嗜酸乳酸杆菌；溃疡性结肠炎；急性期动物模型；肠黏膜屏障
1资料与方法
1.1动物与试剂 动物：雄性C57BL/6小鼠（体重18～22g；7～12w），购于北京维通利华实验动物技术有限公；嗜酸乳酸杆菌 LT0637为湖南康哲中南医药研究有限公司提供，培养液离心后用生理盐水均稀释成1×105 CFU/ml，1×106 CFU/ml，1×107 CFU/ml浓度；右旋葡聚糖硫酸钠（DSS）（Sigma公司美国）；兔抗zo-1抗体（Invitrogen）、 鼠抗occludin抗体（美国Santa Cruz公司）、HRP 抗鼠IgG 、HRP 抗兔IgG （北京中杉有限公司）；主要试剂的配制2%DSS：10 g DSS （分子量36 000～50 000）溶于500 mL蒸馏水中，配成2 %浓度的液体，放入4 ℃冰箱保存。
1.2造模方法 动物造模与急性期造模及不同浓度嗜酸乳酸杆菌干预：50只雄性C57BL/6小鼠按随机数字表随机分入正常对照组、模型组、1×105 CFU/ml嗜酸乳酸杆菌组、1×106 CFU/ml嗜酸乳酸杆菌组、1×107 CFU/ml嗜酸乳酸杆菌组，每组10只；模型组自由饮用2% DSS 7d，正常对照组和不同浓度嗜酸乳酸杆菌组小鼠自由饮用蒸馏水7d；不同浓度嗜酸乳酸杆菌组小鼠自实验开始至结束，每组分别予1×105 CFU/ml嗜酸乳酸杆菌灌胃；1×106 CFU/ml嗜酸乳酸杆菌灌胃；1×107 CFU/ml嗜酸乳酸杆菌灌胃；正常组和模型组予PBS灌胃作对照，时间均为1w，从第8d处死所有动物。
1.3小鼠一般情况及结肠病理组织染色 每天观察小鼠的精神状态、体重、活动情况、毛发光泽度、食欲、大便性状等。在实验结束时处死小鼠，取部分肠段置于多聚甲醛内固定，包埋、切片，HE染色，行组织病理学观察。
1.4结肠组织免疫组织化学荧光染色 新鲜肠组织以5μm的厚度进行连续冰冻切片，按以下步骤进行zo-1和occludin的免疫荧光染色：4%多聚甲醛固定10 min，免疫染色洗涤液洗5 min 3次，封闭液封闭，室温1 h，加兔抗zo-1多克隆抗体/小鼠抗occludin单克隆抗体，4℃过夜，洗涤液洗5 min 3次，滴加标记绿色荧光的抗兔FITC/标记红色荧光的抗小鼠Cy3，室温1 h绿色荧光/红色荧光为阳性表达。阴性对照组用PBS替代一抗，其余步骤同上。
2结果
2.1动物的一般状况 实验期间，正常对照组小鼠大小便正常、体重持续增加、毛发有光泽，饮食、活动、精神状态均正常。急性期模型组动物饮用2%DSS水后第1d，体重增长，饮水和进食较多；饮用DSS第3d，模型组小鼠体重出现下降，饮水和进食明显减少，大便松散，量增多；饮用DSS第5d，小鼠体重下降明显，精神萎靡，体毛凌乱，并出现稀便；实验第8d模型组小鼠体重明显减轻，肛周可见肉眼血便。嗜酸乳酸杆菌组于实验第1d分别予1×105 CFU/ml、1×106 CFU/ml、1×107 CFU/ml灌胃治疗，第2d嗜酸乳酸杆菌组动物体重逐渐回升，精神好转，并出现稀便；第5d，嗜酸乳酸杆菌组动物体重明显增加，大便稀，量多；第7d，嗜酸乳酸杆菌组动物体重回升明显，精神状态良好，饮水和进食较多，大便量多。
2.2嗜酸乳酸杆菌组对小鼠结肠组织病理的影响 正常对照组结肠黏膜光滑，无水肿、充血等表现；模型组小鼠结肠黏膜缺损，腺体破坏或消失，可见黏膜、黏膜下层甚至肌层大量炎性细胞浸润，隐窝增生，组织上皮破损，炎症细胞广泛浸润，呈典型炎症改变。给予嗜酸乳酸杆菌组可见炎症细胞浸润少，炎症程度较模型组明显减轻。1×106 CFU/ml浓度的嗜酸乳酸杆菌对实验性结肠炎小鼠肠道屏障修复作用最明显，减轻炎症细胞浸润效果最佳；1×105 CFU/ml浓度的嗜酸乳酸杆菌、1×107 CFU/ml浓度的嗜酸乳酸杆菌组小鼠结肠病理表现较模型组炎症浸润、病变深度、隐窝破坏均不同程减轻。
2.3免疫荧光染色检测结肠黏膜zo-1、occludin蛋白的定位分布 Zo-1、occludin蛋白的免疫荧光表达更具有特异性。激光共聚焦显微镜下见zo-1蛋白呈现绿光，occludin蛋白呈现红光。急性期正常对照组zo-1、occludin蛋白表达可见荧光沿胞膜分布，荧光强度强，边缘光滑；模型组荧光分布较正常对照组分散，荧光强度减弱，边缘粗糙呈锯齿状；1×105 CFU/ ml、1×106 CFU/ml、1×107 CFU/ml嗜酸乳酸杆菌组荧光仍沿胞膜分布，强度较正常对照组稍减弱，但仍强于模型组；1×105CFU/ml嗜酸乳酸杆菌组和1×107 CFU/ml嗜酸乳酸杆菌组小鼠结肠组织中Zo-1、occludin蛋白表达荧光分布较1×106 CFU/ml嗜酸乳酸杆菌组分散，荧光强度减弱，边缘粗糙呈锯齿状。
3讨论
UC作为一种以肠道症状为主要表现的疾病，且主要发病部位集中在肠道细菌呈高浓度的结直肠部位，结合环境因素的改变继而发病率改变的现象，提示其发病与肠道细菌有密切关系。近年研究更显示肠道菌群的紊乱是诱发的一个重要因素，相关研究报道用粪便灌肠治疗法能缓解肠道炎症，这表明细菌在本病发病中起着重要作用[1]。
参考文献：
[1]Wills ES，Jonkers DM，Savelkoul PH，et al.Fecal microbial composition of ulcerative colitis and Crohn's disease patients in remission and subsequent exacerbation[J].PLoS One，2014，9（3）：e90981.