生物测定法在丹参亲水凝胶骨架片体外释放评价中的应用研究

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[摘要] 该研究探讨生物活性测定法在中药缓控释制剂评价中应用的适宜性，建立一种快速的多组分制剂体外释药评价方法，用表征总体行为的生物活性测定法代替目前单一成分的药物释放度测定法，以更好地指导缓控释制剂处方设计。通过HPLC测定不同溶出介质，不同释药速率及成分间不同配伍比例的丹参亲水凝胶骨架片中各有效成分（丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸）的累积释放度及紫外分光光度法测定释放液的抗氧化活性，对药物各成分经时曲线与总抗氧化活性经时曲线之间的相关性进行评价。发现各成分的释放曲线与抗氧化活性经时曲线的相关系数r均大于临界r=0.898（P

[关键词] 生物测定法；体外释药；抗氧化活性；亲水凝胶骨架片；多组分制剂；丹参

[收稿日期] 2013-04-20

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81274079）；国家重点基础研究发展计划（973）项目（2012CB724000）；国家“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09103201-009，2012ZX09103201-027）

[通信作者] 王智民，研究员，主要从事中药药效物质基础及质量评价研究，Tel/Fax：（010）84014128，E-mail：；刘晓谦，博士，主要从事中药制剂研究，E-mail：

[作者简介] 李东影，硕士研究生，E-mail：

近年来，随着疾病谱和临床用药的改变，以单靶点直接对抗治疗为代表的新药研发模式面临着严峻的挑战，而基于系统生物学多靶点、多组分药物的研究已经成为新药开发的热点。尤其是随着缓控释制剂优势的不断凸显，含有多组分的口服缓控释给药系统已成为新型给药系统研究的热点。但随之而来的如何真实、客观地评价多组分缓控释给药系统的综合作用特点，反映制剂的内在质量，成为制约多组分缓控释制剂发展的瓶颈。现有的通过对1个或几个指标成分或有效成分的释药数据进行体外释药评价模式，难以反映制剂的整体行为，因而难以指导多组分制剂的药物设计。本研究以临床基础较好的中药――丹参为研究对象，探索建立一种快速、灵敏、高效的，能够反映多组分制剂整体释药特性的方法。

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎[1]，具有活血祛瘀[2]、凉血清心、养血安神的功效。现代药理研究已证实酚酸类成分为其抗老年痴呆[3]、降糖降脂、抗动脉粥样硬化[4]、抗肿瘤[5]、抗肝纤维化[6-7]、镇痛[8]及神经保护[9]作用的药效成分；而上述疾病的发生发展均与自由基、氧化应激等环节或机制密切相关[10-11]。这些酚酸类成分在体内易于被消除，如丹酚酸B的半衰期约9 min，具有开发为缓控释制剂的可行性。本研究以丹参的主要水溶性酚酸类成分为对象，通过制备不同释药速率、不同成分间配伍比例的缓释制剂，对其释药性能、释放过程中抗氧化经时曲线进行研究，探讨其相关性，进而探索抗氧化活性在评价多组分缓释制剂体外释药过程中的可行性和适用性。

1 材料

Shimadzu LC 20A高效液相色谱仪，包括LC-20AT溶液传输单元，SIL-20A自动进样器，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC Solution色谱工作站（日本岛津公司）；T6 新世纪 UV-VIS分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SR8PLUS全自动溶出仪（美国汉森）。KQ-250DE型数控超声波清洗器（功率250 W，工作频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司） ；XS205型1/10万天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）。

原儿茶醛（批号0810-9402）、迷迭香酸（批号111871-201001）均购自中国食品药品检定研究院；丹酚酸B（批号D-012-110812）购于成都瑞芬思生物科技有限公司；DPPH试剂（Lot # AL030101）购于Alfa Aesar公司；丹参骨架片（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱方法

2.1.1 色谱条件[12-13] Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-3%甲酸溶液（B），梯度洗脱，0～80 min，0%～33%A，流速 1 mL・min-1；柱温30 ℃；检测波长280 nm；进样量10 μL。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品10片，研细，精密称取15 mg，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声溶解，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，立即经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 专属性试验 取丹参骨架片的空白辅料适量（约1片量），制备空白辅料样品，按2.1.1及2.1.2项下方法进样10 μL，在与对照品溶液色谱图中相同的保留时间处无色谱峰出现，证明空白辅料对测定无干扰，结果见图1。

2.1.4 对照品溶液的制备及标准曲线 精密称取原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B对照品适量至25 mL量瓶中，甲醇溶解配制成含原儿茶醛4.3 mg L-1、迷迭香酸10.4 mg・L-1、丹酚酸B 61 mg・L-1的混合对照品溶液，作储备液。分别精密移取上述对照品储备液5.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.80，0.50，0.10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，依次测定峰面积，以峰面积为纵坐标，质量浓度（mg・L-1）为横坐标，进行线性回归，得到各成分的回归方程以及线性范围。结果表明，丹参酚酸混合对照品溶液在线性范围内线性关系良好，见表1。

2.1.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，分别于同天重复进样6次，按2.1.1项下色谱条件测定峰面积，计算RSD，记作日内精密度；另精密吸取混合对照品溶液10 μL，重复进样3次，连续进样3 d，测定峰面积，计算RSD，记作日间精密度。原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的日内精密度分别为0.56%，0.41%，0.30%，日间精密度分别为0.53%，1.0%，0.94%，表明仪器精密度良好。

1.原儿茶醛；2.迷迭香酸；3.丹酚酸B。

图1 混合对照品溶液（A）、空白辅料（B）及样品溶液（C）HPLC图

Fig.1 HPLC chromatograms of mixed control solution（A）， excipient solution（B） and sample solution（C）

表1 原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸B的回归方程、相关系数及线性范围

Table 1 Regression equations and ranges of three phenolic acids from Salvia miltiorrhiza

2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0，3，6，9，12，18，24，36，48 h进样，记录峰面积，考察其溶液稳定性，原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B峰面积的RSD分别为2.3%，1.7%，3.4%，表明供试品溶液48 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批号丹参骨架片（自制），按2.1.2项下方法制备6份供试品溶液，进样10 μL，记录峰面积，计算含量。丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸的平均质量分数分别为7.76%，0.043%，0.35%，RSD分别为2.7%，4.2%，3.4%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 分别精密吸取已知浓度的供试品溶液5 mL（分别含有丹酚酸B 116.57 μg，迷迭香酸5.36 μg，原儿茶醛0.64 μg），置于9支10 mL量瓶中，分别精密量取含丹酚酸B、迷迭香酸、原儿茶醛对照品溶液置于9支量瓶中（低、中、高质量浓度组各平行3份），加水振摇定容至10 mL。分别用0.22 μm微孔滤膜过滤后进样10 μL检测，计算加样回收率，见表2。

表2 丹酚酸B、迷迭香酸、原儿茶醛的加样回收率

Table 2 Recoveries rate of three phenolic acids from Salvia miltiorrhiza

2.2 释放度试验

取自制丹参骨架片6片，采用2010年版《中国药典》二部附录XD第2法[1]以纯水900 mL作为释放介质，50 r・min-1，（37±0.5） ℃，于0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8 h定时取样5 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液注入液相色谱仪，分别测定丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸的峰面积，计算各成分的累积释放度，结果见图2。

采用相似因子法[14]对迷迭香酸、原儿茶醛与丹酚酸B溶出曲线进行比较，相似因子分别为81.91，62.12（均大于50），表明各成分间释放速率无显著差异。

图2 丹参骨架片3个酚酸类成分的体外累积释放曲线

Fig.2 Drug release kinetics of active components from formulations in vitro

2.3 抗氧化经时曲线的绘制

取上述各个溶出时间点溶出液，0.22 μm滤膜过滤，分别取0.5 mL与0.1 mmol・L-1DPPH乙醇溶液3 mL反应30 min，测定吸光度值，计算清除率。以溶出时间为横坐标，DPPH自由基清除率为纵坐标，绘制抗氧化经时曲线，结果见图3。

图3 丹参骨架片各时间点释放液抗氧化活性经时曲线

Fig.3 Antioxidant activity kinetics of release liquid in vitro

2.4 成分经时曲线与抗氧化活性经时曲线的相关性分析

考察抗氧化活性与累计释放度之间的相关性，以各成分各时间点累计释放度为横坐标，各时间点总抗氧化活性为纵坐标，绘制曲线，计算回归方程及相关系数r，结果表明，相关系数均大于临界值r0.001=0.898，说明成分经时曲线与抗氧化活性经时曲线相关性良好，见表3。

表3 成分累计释放曲线与抗氧化活性经时曲线相关性

Table 3 The correlation of drug release and antioxidant activity

2.5 不同释药速率的影响

2.5.1 释放度及抗氧化活性经时曲线绘制 通过调节控释材料的用量，制备不同释药速率的丹参亲水凝胶骨架片（T1，T2，T3）及普通片（T4）。按照2.2及2.3项下方法绘制得到不同释药速率片剂中3种酚酸类成分的释放度曲线及总抗氧化活性经时曲线，结果见图4，5。

图4 不同释药速率的丹参骨架片中丹酚酸B（A）、迷迭香酸（B）、原儿茶醛（C）的累积释放曲线

Fig.4 Drug release kinetics of active components from tablets with different release rate

图5 不同释药速率丹参骨架片释放液的抗氧化活性经时曲线

Fig.5 Antioxidant activity kinetics of release liquid from tablets with different release rate

由上图可知，所设计的普通片及3个缓释片的体外释放行为具有显著性差异，抗氧化活性的强弱与各成分的累积释放量呈正相关。

2.5.2 成分、抗氧化活性经时曲线的相关性分析 按照2.4项下方法，考察不同释药速率的丹参片抗氧化活性与累计释放度之间的相关性，结果见表4。

表4 不同释放速度丹参片成分累积释放曲线与抗氧化活性经时相关性

Table 4 The correlation of drug release and antioxidant activity of tablets with different release rate

由表4可知，其相关系数均大于临界r0.001=0.898，表明释药速率对二者的相关性无影响，体外累计释放曲线与抗氧化经时曲线有很好的相关性。

2.6 不同释放介质的影响

2.6.1 释放度及抗氧化经时曲线的绘制 选取丹参骨架片T3，按照2.2及2.3项下方法，分别测定其在水、0.1 mol・L-1HCl、pH 7.4 磷酸盐缓冲液中的释放度及各时间点抗氧化活性，绘制得到T3中3种酚酸类成分在不同溶出介质中的累积释放曲线及抗氧化活性经时曲线，结果见图6，7。

释放介质对各成分的释放度有不同程度影响，丹酚酸B、迷迭香酸、原儿茶醛在水与pH 7.4 磷酸盐缓冲液中释放曲线相似因子分别为66.94，66.19，50.48，释放行为相似，但是在0.1 mol・L-1 HCl中丹酚酸B释放速率较低。抗氧化活性与成分的累积释放度呈正相关。

2.6.2 成分、抗氧化活性经时曲线的相关性分析 按照2.4项下方法，考察不同释放介质中丹参片抗氧化活性经时曲线与各成分释药曲线之间的相关性，结果见表5。

图6 丹参骨架片中丹酚酸B（A）、迷迭香酸（B）、原儿茶醛（C）在不同释放介质中的累积释放曲线

Fig.6 Drug release kinetics of active components in different dissolution media

图7 不同释放介质中释放液抗氧化活性经时曲线

Fig.7 Antioxidant activity kinetics of release liquid in different dissolution media

由表5可知，其相关系数均大于临界r0.001=0.898，体外累计释放曲线与抗氧化活性经时曲线之间相关性良好，表明释放介质对二者的相关性无显著影响。

2.7 成分间不同配伍比例的影响

2.7.1 释放度及抗氧化活性经时曲线绘制 通过制备3批丹参提取物（丹酚酸B、迷迭香酸、原儿茶

表5 不同溶出介质中各成分释放度与抗氧化活性相关性

Table 5 The correlation of drug release and antioxidant activity in different dissolution media

醛之比分别为120∶5∶1，80∶4.5∶1，17∶0.6∶1），以此为模型药物，分别制备丹参亲水凝胶骨架片，记作T5，T6，T7。按照2.2及2.3项下方法绘制得到成分间不同配伍比例骨架片中3种酚酸类成分的释放度曲线及总抗氧化活性经时曲线，结果见图8，9。

图8 成分间不同配伍比例的丹参骨架片中丹酚酸B（A）、迷迭香酸（B）、原儿茶醛（C）累积释放曲线

Fig.8 Drug release kinetics of active components from formulations with different component ratio

图9 成分间不同配伍比例丹参骨架片释放液总抗氧化活性经时曲线

Fig.9 Antioxidant activity kinetics of release liquid from formulations with different component ratio

成分间不同配伍比例的骨架片中3种酚酸类成分释放曲线相似因子均大于50，表明成分间不同配伍比例释放行为无显著差异，成分间比例对上述3种成分的释放无影响，三者均以恒定比例释放，表现在抗氧化活性经时曲线上3个处方也较为一致。

2.7.2 成分、抗氧化活性经时曲线的相关性分析 按照2.4项下方法，考察成分间不同配伍比例的丹参片抗氧化活性与累计释放度之间的相关性，结果见表6。

表6 成分间不同配伍比例丹参片各成分释放度与抗氧化活性相关性

Table 6 The correlation of drug release and antioxidant activity of different component ratio

由表6可知，其相关系数均大于临界r0.001=0.898，表明成分间不同配伍比例骨架片中体外累计释放度与抗氧化活性之间相关性良好。

3 讨论

本研究探讨了生物测定法应用于丹参酚酸类成分亲水性骨架片体外释放度评价的适宜性，主要是基于丹参水溶性部分主要成分――酚酸类成分均有很好的抗氧化活性[15-18]的考虑，拟以总抗氧化活性作为总体释药情况的表征，代替单一成分的体外释药行为，通过对其与成分释药行为的相关性评价，揭示生物测定法在多组分制剂体外释药评价应用中的可行性和技术适宜性。

通过对不同释药速率的3种骨架片累积释放曲线与抗氧化经时曲线的相关性分析，可以看出抗氧化活性的强弱直接与成分的溶出有关。抗氧化活性经时曲线能够很好地表征3个酚酸类成分的释放行为。

为进一步证实方法的可行性，分别设计了不同变异条件（成分间不同配伍比例、不同释放介质），并对相应的成分累积释放曲线和抗氧化经时曲线进行相关性考察，结果表明上述条件的改变不会影响二者的相关性。证实所建立的基于抗氧化活性生物测定的多组分释药评价方法能够很好地表征成分的释放行为。初步判定采用抗氧化生物活性评价丹参骨架片的体外释放度是可行的，能够较客观地反映药物的体外释放度。

值得注意的是，在水及pH 7.4 磷酸盐缓冲液中各成分累计释放度相似，8 h后各成分的释放度达到85%以上，但pH 7.4 磷酸盐缓冲液体系中，对DPPH自由基清除能力较弱，因此还考察了缓冲盐对DPPH反应的影响，结果表明，当体系中存在缓冲盐时，反应产生沉淀，影响活性测定，无法准确的表达释放液活性，在测定时，应注意缓冲盐对反应的影响，并注意过滤后再进行检测，以避免沉淀对结果的干扰。但通过对累积释放曲线与抗氧化活性经时曲线进行相关性分析，二者仍具有较好的相关性。不过在试验中建议尽量避免选择具有缓冲盐的缓冲溶液体系作为释放介质，如必要，需对结果进行一定校正。

抗氧化活性与多种疾病的发生、发展均密切相关，且多种成分均证实具有较好的抗氧化活性，将抗氧化生物活性评价方法引入到多组分固体缓控释制剂的体外释放度研究，本课题组将在今后的工作中继续完善、丰富，以期建立化学和生物活性相关联的评价方法，更好地控制多组分缓控释制剂的质量。

[参考文献]

[1] 中国药典.一部[S].2010： 70.

[2] 吴燕燕， 孙煜， 王易.丹参多酚酸盐活血化瘀作用的多元化药理作用[J].中国现代应用药学， 2010， 27（11）： 975.

[3] Airoldi C， Sironi E， Dias C， et al.Natural compounds against Alzheimer′s disease： molecular recognition of Aβ1-42 peptide by Salvia sclareoides extract and its major component， rosmarinic acid， as investigated by NMR[J].Chem Asian J， 2013， 8（3）： 596.

[4] Huang M， Xie Y， Chen L， et al.Antidiabetic effect of the total polyphenolic acids fraction from Salvia miltiorrhiza Bunge in diabetic rats[J].Phytother Res， 2012，26（6）： 944.

[5] Wei J， Xie G， Ge S， et al.Metabolic transformation of DMBA-induced carcinogenesis and inhibitory effect of salvianolic acid b and breviscapine treatment[J].J Proteome Res， 2012， 11（2）： 1302.

[6] Cheng Y， Ping J， Liu C， et al.Study on effects of extracts from Salvia miltiorrhiza and Curcuma longa in inhibiting phosphorylated extracellular signal regulated kinase expression in rat′s hepatic stellate cells[J].Chin J Integr Med， 2006， 12（3）： 207.

[7] Zhang X L， Liu L， Jiang H Q.Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3 induces hepatic stellate cell apoptosis via caspase-3 activation[J].World J Gastroentero， 2002， 8（3）： 515.

[8] Isacchi B， Fabbri V， Galeotti N， et al.Salvianolic acid B and its liposomal formulations： anti-hyperalgesic activity in the treatment of neuropathic pain[J].Eur J Pharm Sci， 2011， 44（4）： 552.

[9] Yu X， Zhang L， Yang X， et al.Salvianolic acid A protects the peripheral nerve function in diabetic rats through regulation of the AMPK-PGC1α-Sirt3 axis[J].Molecules，2012， 17（9）：11216.

[10] Joon-Kwan Moon， Takayuki Shibamoto.Antioxidant assays for plant and food components[J]. Food Chem， 2009（57）： 1655.

[11] L M Cheung， Peter C K Cheung， Vincent E C Ooi.Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts[J].Food Chem， 2003（81）： 249.

[12] 杨菲，王智民，张启伟，等.“一测多评”法测定丹参酚酸类成分的含量[J].中国中药杂志，2011，36 （17）：2372.

[13] 李献玉.HPLC同时测定丹酚酸B和阿魏酸的含量[J].中国现代应用药学， 2011， 28（13）： 1355.

[14] 杜守颖，陈雯，吴清，等.仙灵骨葆胶囊中丹参酮Ⅱa溶出度测定方法研究[J].中国中药杂志，2010，35 （13）：1706.

[15] 刘梅，夏鑫华，张志敏，等.丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和丹酚酸B体外抗氧化活性比较研究[J].中药材，2009，32 （2）：265.

[16] Zhao Guang-Rong， Zhang Heng-Ming， Ye Ting-Xiang， et al.Characterization of the radical scavenging and antioxidant activities of danshensu and salvianolic acid B[J].Food Chem Toxicol， 2008 （46）： 73.

[17] Wang Song， Gao Zhen， Li Erlin， et al.The application with protocatechualdehyde to improve anticoagulant activity and cell affinity of silk fibroin[J].Appl Surf Sci， 2008 （255） ： 486.

[18] Chen Hui， Chen Feng， Zhang Yin-Lin， et al.Production of rosmarinic acid and lithospermic acid B in transformed Salvia miltiorrhiza cell suspension cultures[J].Process Biochem， 1999 （34）： 777.

Study on application of bioassay method in drug-release evaluation in vitro of

Salvia miltiorrhiza hydrophilic gel matrix tablets

LI Dong-ying LIU Xiao-qian FENG Wei-hong WANG Zhi-min YI Hong MENG Qing-ju

（1.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2.National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Beijing 100700， China；

3.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China）

[Abstract] To investigate the feasible application of the bioassay method in the evaluation of traditional Chinese medicine sustained-release preparations， develop a rapid drug-release evaluation method in vitro for multi-component preparations， and replace the biological activity determination method characterizing the overall behavior with the existing drug-release evaluation method for single component， in order to give better instruction for sustained-release preparations.HPLC was adopted to determine dissolution media， drug releasing rates， and accumulative releasing of active ingredients （salvianolic acid B， protocatechuic aldehyde and rosmarinic acid） of Salvia Miltiorrhiza hydrophilic gel matrix tablets.The ultraviolet spectroscopy was adopted to determine the antioxidant activity of release media， and evaluate the correlation between the drug-time curve of various drug components and the drug-time curve of the total antioxidant activity.The correlation coefficient between the drug-release curve of various components and the drug-time curve of the total antioxidant activity was higher than the critical value r 0.898 （P

[Key words] bioassay method； drug-release in vitro； antioxidant activity； hydrophilic gel matrix tablets； multi-component preparation； Salvia miltiorrhiza

doi：10.4268/cjcmm20132217