肝素锂目前在我国的应用研究进展

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[摘 要]血栓性疾病是由血栓形成引起血管管腔狭窄与闭塞，使主要脏器出现缺血和梗塞，从而引发机能障碍的心、脑血管系统疾病。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年约有1，200万人死于脑血栓、脑梗死、心肌梗死、冠心病、动脉硬化等疾病，接近世界总死亡人数的1/4，心、脑血管系统疾病可谓人类健康的头号大敌。我国每年估计死于心脑血管疾病的人数达到260万人以上，存活者中有75%的患者因病致残，40%以上为重度致残。抗凝产品成为治疗这类疾病的常备药物。据统计，在中国抗凝血销量位列抗血栓药第二，占32%，已接近抗血小板药物。

[关键词]肝素锂；疾病

中图分类号：S157.1 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）45-0345-01

0 引言

随着近年来我国人口老龄化程度日益加剧，血栓性疾病的发生率不断上升，抗血栓药市场容量不断扩增。其中肝素类抗凝药所占份额几乎逐年增加，目前全国使用抗血栓药物总金额在14亿～15亿人民币之间，年增长率在15%～20%左右。从全国主要城市典型医院用药情况来看，该类药物市场一直呈现持续稳步增长的态势。

我国肝素及其衍生物的生产品种主要是肝素钠、肝素钙及低分子肝素，肝素锂在我国尚未大规模生产。统计数据显示，随着人类平均寿命的延长，生活环境和膳食习惯的变化，心、脑血管病的发病率和死亡率正逐年增高。目前，我国脑血栓（缺血性中风）患者多达700万人，大部分幸存者留有后遗症，需长期住院或家庭照顾。按20%的就诊率、该类患者的人均用药费用以每年5，000元计，该市场的理论年销售额约为70亿元，仅2011年一年中国国内低分子肝素的市场就有7亿人民币左右，相较而言，美国的市场额达到56亿美元左右，而且两者都呈现逐年递增趋势，且在相当长的一段时间其仍将保持增长势头。与此同时，新产品的引进和新型抗血栓药物的成功开发成为市场发展的重要因素，为抗血栓药物市场的快速发展奠定了坚实基础。

肝素（heparin）是一种黏多糖类物质，由动物结缔组织的肥大细胞产生，广泛存在于动物器官和组织中，如肠黏膜、十二指肠、肺、肝、心脏和血液中，经盐解和离子交换等工艺处理后成为生化药物肝素钠、肝素钙、肝素锂以及肝素锌等。常用的肝素抗凝剂，肝素的钠、钾、锂、铵盐中，其中以肝素锂最好，用肝素锂作为抗凝剂已逐渐取代肝素钠。

肝素锂是分子量不同的酸性粘多糖相混合的硫酸氨基多糖的锂盐，对热稳定，对一般微生物及酶不敏感，为白色或类白色无定形粉末。具有吸湿性，易溶于水（1：20），不易溶于乙醇、乙醚、丙酮、二氧六环等有机溶剂，具有两性化合物特点，在酸性水溶液中容易水解，而在碱性溶液中则很稳定，pH越高，稳定性越大。

肝素锂的优点是：锂的含量（3.5-4.5%）比钠（9.5-12.5%）少，因此减少了血中微纤维形成的可能。排除了同一样本测定钠时的错误干扰。用肝素锂、肝素锌在发达国家已有多年，对提高血检准确度有重要作用。主要用于临床血液检验中全血细胞计数、血气、血氨、血沉、急诊生化检验、血糖、骨髓检验、造血干细胞培养等项目，可快速分离血浆不影响酶和电解质测定，提高检验效率，降低检验成本，是各采血管生产企业、医院等血液检验机构的首选。用肝素锂取代肝素钠进行血液生化指标检验早已流行于欧美等发达国家，是目前血液检验的发展趋势，代表了当今世界血液生化检测的方向和趋势。

1 国内外技术现状

肝素锂主要用于临床血液检验中全血细胞计数、血气、血氨、血沉、急诊生化检验、血糖、骨髓检验、造血干细胞培养等项目，可提高检验效率，降低检验成本，是各采血管生产企业、医院等血液检验机构的首选。

传统的肝素提取方法主要采用多步盐解的方法将肝素与蛋白解离，再用高盐将肝素从树脂上洗脱下来，然后酸化除蛋白。具体的工艺路线：健康、新鲜的牛肺，洗净后，用破碎机将牛肺绞碎。然后用蒸馏水按1：1比例稀释绞碎的牛肺投入反应锅，按3%加入NaCl，用30%氢氧化钠调PH9.0，于530～550℃保温提取2h。继续升温至950℃，维持10min，冷却至500℃以下，过滤、收集滤液。加入714强碱性Cl-型树脂，树脂用量为提取液的2%，搅拌吸附8h，静置过夜。收集树脂，用水冲洗至洗液澄清、滤干，用2倍量1.4mol/L NaCl搅拌2h，滤干。用2倍量3mol/L NaCl搅拌洗脱8h，滤干，再用1倍量3mol/L NaCl搅拌洗脱2h，滤干。合并滤液，加入等量95%乙醇沉淀过夜，收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥得粗品，粗品中加入盐酸保温，除去酸性蛋白，再加入碱恒温沉淀除去碱性蛋白，乙醇多次分级沉淀得到精品。这样的产品不仅硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素等杂质的含量高，而且肝素的生物活性破坏严重，对后续的精制也造成较大困难。

国外目前对动物中提取肝素方法应用逐渐减少，主要对低分子肝素的研究较多，常用方法主要有化学裂解法和酶降解法。虽然化学裂解法工艺流程较简单，但裂解过程中加入的强氧化剂会与肝素中的硫酸基团作用而引起肝素抗凝活性的降低，此外这种方法还可能引入毒物而污染环境，而酶降解法由于其温和的反应条件且无毒性易实现生产连续化而越来越得到人们的关注。酶降解法中主要研究采用来自肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）的肝素酶I来制备低分子肝素，因其产量低、纯化困难，造成酶的成本非常昂贵，限制了酶法制备低分子肝素的发展。利用重组菌株生产肝素酶I是一条极有前景的途径，但通常的表达体产生的肝素酶I容易形成包涵体，无法直接利用。国外的这些方法在我国来说尚不符合国情，因此在我国还是以动物脏器为原料，提取肝素粗品更合适我国国情，而且成本低廉，污染小。

2 技术特点

肝素在动物组织中以共价键的形式结合于蛋白之上，需进行水解才能使其解离下来。动物脏器往往自身含有一定的蛋白水解酶，可以让其自溶，但需要20小时的时间。有生产工艺采用加入胰蛋白酶酶解与盐解离相结合的方法分离肝素与蛋白，采用离子交换的方法直接洗脱得到肝素锂粗品。粗品精制中，采用温和的蛋白沉淀剂分离除去杂蛋白，较低浓度的氧化剂氧化脱色，得到的精品肝素锂生物效价较高，产品收率明显提高、质量稳定，注射级精品产品质量达到欧美药典要求。该工艺主要技术特点总结如下：

2.1 采用酶解+盐解的方法解离蛋白

肝素在生物组织中和蛋白质结合为糖蛋白，复合蛋白是无活性的，随着蛋白质的去除而活性增加，因而肝素是否和蛋白质解离完全是影响肝素收率和效价的重要因素。单独采用盐解或酶解工艺都不能得到理想效果，因而，采用胰酶酶解后再用盐解工艺，蛋白质解离完全，获得较高收率。

2.2 精制工艺中加入蛋白沉淀剂

在肝素精制工艺中采用添加少量沉淀剂的方法除去肝素粗品中的杂蛋白，条件相对温和，对肝素的活性影响在2%以下，避免了常规工艺中使用酸去酸蛋白、碱除碱蛋白造成的生物效价的损失。

2.3 工艺操作步骤少，生产效率高

传统肝素的生产需要反复过滤，但肝素为多糖类，溶液粘度高，多次过滤时间操作时间长，产物损失大。本项目采用离子交换、超滤、高速离心等现代分离提取方法，大大提高生产效率，产品质量达到药典要求。

2.4 直接以牛肺等动物脏器为原料，制备肝素锂精品

直接采用离子交换法，以树脂吸附肝素，锂盐洗脱直接得到肝素锂粗品。

综上，肝素锂在我国的生产原材料丰富，提取工艺尚需改进完善，医药用途广泛，临床需求潜力巨大。