中药注射液体外肾细胞毒性评价的方法学探讨

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[摘要] 目的 研究柴胡注射液和丹参注射液在犬肾近端小管上皮细胞（MDCK细胞）和人胚肾细胞（HEK-293细胞）模型的毒性作用，并探讨中药注射液体外肾细胞毒性检测的实验方法。 方法 选用马兜铃酸A作为阳性对照，将不同厂家和批次的丹参注射液、柴胡注射液的原液及稀释液，与MDCK细胞或HEK-293细胞共同孵育，通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）量化细胞毒性，计算相对增殖率，进行中药注射液体外肾细胞毒性评价。 结果 在MDCK细胞模型中，两批丹参注射4个液稀释浓度下毒性分级显示为0级，一批稀释9、27、81倍后显示为0级，柴胡注射液稀释27、81倍后显示为0级；在HEK-293细胞模型中，一批丹参注射液4个稀释浓度下毒性分级显示为1级，一批稀释9、27、81倍后显示为1级，一批稀释27、81倍后显示为1级；柴胡注射液稀释27、81倍后显示为2级。 结论 利用肾脏细胞来源的细胞，可尝试建立中药注射液体外肾细胞毒性检测的实验方法。

[关键词] 中药注射液；肾；细胞毒性；四甲基偶氮唑盐比色法

[中图分类号] R285.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（a）-0011-04

[Abstract] Objective To study the cytotoxicity of Salvia Injection and Bupleurum Injection in MDCK cells and HEK-293 cells and discuss the applicability of these experimental methods. Methods Aristolochic acid A was selected as a positive control drug. MDCK cells and HEK-293 cells were incubated with different concentrations of Salvia Injection or Bupleurum Injection. Then cytotoxicity was evaluated with MTT assay and relative growth rate （RGR） was calculated. Results In MDCK cell model， the RGR from two batches of Salvia Injection were shown as Class 0 after diluting 4 levels and one was shown as Class 0 after diluting 9， 27， 81 times. The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 0 after diluting 27， 81 times. Meanwhile， in HEK-293 cell model， the RGR from one batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 4 levels. One batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 9， 27， 81 times. One was shown as Class 1 after diluting 27， 81 times. The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 2 after diluting 27， 81 times. Conclusion The use of kidney-derived cells can help to establish experimental methods to test the Chinese medicine injection nephrotoxicity.

[Key words] Chinese medicine injection； Kidney； Cell toxicity； MTT assay

中药所致的肾脏损害在世界范围内日益受到重视，目前显示许多中药具有肾毒性作用[1]，中药肾毒性已经严重制约了中药在临床上的使用。中药注射液大部分都是经血管给药，其对肾脏损害的风险性更应提高警惕，如穿心莲内酯注射液已发现可导致患者急性肾损害[2]。因此，建立一个快捷有效的中药注射液肾毒性评价方法具有重要的意义。

目前体外细胞毒性试验广泛应用于生物材料、医疗器械和药品包装材料的毒性研究[3-5]，可以对受试物潜在的细胞毒性进行检测。在中药注射液方面，有研究选用小鼠成纤维细胞（L929细胞）进行体外细胞毒性的分析[6-7]，但用肾脏来源的细胞进行中药注射液的肾毒性体外评价的研究少见报道。本研究选用来源于肾脏的犬肾近端小管上皮细胞（MDCK细胞）和人胚肾细胞（HEK-293细胞），参考中药注射液在L929细胞毒性检测的四甲基偶氮唑盐比色法 （MTT法）[6]，考察中药注射液对MDCK细胞和HEK-293细胞的体外细胞毒性作用，对建立基于MDCK细胞或HEK-293细胞的中药注射液体外肾细胞毒性模型进行探讨。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

柴胡注射液（广东罗浮山国药股份有限公司，批号L13C302），丹参注射液（广东远大药业有限公司，批号130501、130502、130503）。马兜铃酸A（中国药品生物制品检定所，批号110746-200406）。马兜铃酸A用二甲基亚砜（DMSO，终浓度为0.5%）溶解，配成100 μmol/mL储存液。实验时，用DMEM培养液稀释至实验浓度。DMEM培养液（GIBCO公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。胰酶（吉诺生物医药技术有限公司）。乳酸脱氢酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）。其他试剂为国产分析纯试剂。

1.2 仪器

电子天平（Sartorius，德国）；Eppendorf离心机。生物安全柜（Nuaire，美国）；二氧化碳培养箱（Sanyo，日本）；倒置相差显微镜（Olympus，日本）；多功能酶标仪（Molecular Devices，美国）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 MDCK细胞和HEK-293细胞均购自中山大学实验动物中心细胞库。取对数生长期的MDCK细胞和HEK-293细胞用胰酶消化后制成细胞悬液，用DMEM培养基（含10%胎牛血清）以105个/mL的细胞浓度接种于96孔细胞培养板内，每孔100 μL。置37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中培养24 h。

1.3.2 MTT法检测马兜铃酸A对MDCK细胞和HEK-293细胞的抑制作用 用DMEM培养液将马兜铃酸A分别配制成0.5、5、50、500 nmol/L四种不同的浓度（各自DMSO终浓度为0.5%）。96孔板内细胞分为对照组、马兜铃酸A四种不同浓度组，每组6孔。对照组更换含0.5%DMSO的DMEM培养液；马兜铃酸A各浓度组更换为含0.5、5、50、500 nmol/L马兜铃酸A的DMEM培养液。每孔100 μL，培养24 h后进行MTT检测。

1.3.3 中药注射液稀释及培养 将中药注射液用DMEM培养液按1∶3、1∶9、1∶27、1∶81进行稀释，空白对照为DMEM培养液。将上述样品液及对照液分别加入接种MDCK细胞或HEK-293细胞的96孔板内，每孔100 μL。继续培养24 h后采用MTT法进行检测并计算细胞相对增殖率并对细胞毒性进行评价。

1.3.4 MTT法检测中药注射液对MDCK细胞和HEK-293细胞的细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR）及细胞毒性评价 RGR的计算公式：RGR（%）=（试验组平均OD值）/（对照组平均OD值）×100%；细胞毒性评价标准参考GB/T14233.2-2005细胞毒性试验[8]。依据RGR对毒性反应分级，其中0级：RGR≥100%，为无毒性；1级：80%≤RGR

1.3.5 MTT检测方法 参考相关文献进行检测[9]，细胞培养结束前4 h，取出培养板，每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃培养液，每孔加入DMSO 150 μL，混匀，用酶标仪测定光密度值（OD值），测定波长为490 nm。

1.4 统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。先进行方差齐性检验，各组方差齐用LSD进行统计，若方差不齐，用Tamhane's T2进行统计。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 马兜铃酸A对MDCK细胞和HEK-293细胞的抑制作用

当MDCK细胞给予0.5、5、50、500 nmol/L的马兜铃酸A孵育24 h后，OD值均出现下降。与对照组比较，50、500 nmol/L组的OD值明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。HEK-293细胞给予0.5、5、50、500 nmol/L的马兜铃酸A孵育24 h后，50、500 nmol/L组的OD值也明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。说明马兜铃酸A对MDCK细胞和HEK-293细胞增殖均具有明显的抑制作用。

2.2 中药注射液对MDCK细胞相对增殖率的影响

3个批次的丹参注射液和1个批次的柴胡注射液对MDCK相对增殖率的影响见表2。由表可见，2个批次（批号130501和130503）的丹参注射液4个稀释浓度的细胞毒性分级均为0级。1个批次（批号130502）稀释9、27、81倍后细胞毒性分级均为0级。柴胡注射液稀释27、81倍后显示为0级。

2.3 中药注射液对HEK-293细胞相对增殖率的影响

3个批次的丹参注射液和1个批次的柴胡注射液与HEK-293孵育24后，毒性分级结果显示，同一批丹参注射液（批号130502）4个稀释浓度的细胞毒性分级均为1级，同一批（批号130501）稀释9、27、81倍后显示为1级，一批（批号130503）稀释27、81倍后显示为1级。柴胡注射液稀释27倍后显示为27、81级。见表3。

3 讨论

马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ是马兜铃酸的两个主要成分[10]，其中马兜铃酸Ⅰ（又名马兜铃酸A）是马兜铃酸的主要毒性成分[11]，具有明显的肾毒性作用[12]。有研究显示马兜铃酸在体外可明显抑制大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E细胞）增殖并诱导细胞凋亡[13]，MDCK细胞也是一种肾小管上皮细胞，常用于中药成分的体外肾毒性评价研究[14-15]，故本实验选用MDCK细胞作为中药注射液体外肾毒性评价的细胞模型。实验结果显示，马兜磷酸A均能够显著抑制MDCK细胞和HEK-293细胞的增长，可选用为该细胞模型的阳性对照药。为了探讨体外肾细胞毒性模型对不同批次和不同品种的中药注射液的毒性反应，本研究选用了三批丹参注射液和一批柴胡注射液进行考察，参考GB/T14233.2-2005细胞毒性试验对中药注射液体外肾细胞的毒性反应进行分级。实验结果显示，在MDCK细胞模型中，两批丹参注射液4个稀释浓度下毒性分级显示为0级，一批稀释9、27、81倍后显示为0级，柴胡注射液稀释27、81倍后显示为0级；在HEK-293细胞模型中，一批丹参注射液4个稀释浓度下毒性分级显示为1级，一批稀释9、27、81倍后显示为1级，一批稀释27、81倍后显示为1级；柴胡注射液稀释27、81倍后显示为2级。中药注射液诸多因素均可引起细胞毒性，如主要的中药成分、pH值、渗透压、药品辅料等均可以引起细胞死亡。因此，本实验不同批次和不同品种的中药注射液之间毒性反应分级可能存在较大的差异。若建立起稳定的体外细胞毒性模型，对同一品种的中药注射液进行多批次的毒性检测并进行毒性分级，综合分析数据后或许可对中药注射液的肾毒性安全性评价提供有意义的参考数据。

在本实验中，不同种属来源的MDCK细胞和HEK-293细胞对同一批次的中药注射液的毒性显示出不同的灵敏度，因此，建立中药注射液体外肾细胞毒性模型还可以选用多种来源的肾细胞，如人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）等[16]，进行对比分析，或许最终能从诸多肾脏来源的细胞中建立起一个稳定可靠的中药注射液体外肾细胞毒性模型对中药注射液的肾毒性进行安全性评价。

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（收稿日期：2014-05-19 本文编辑：卫 轲）