发育中小鼠胰腺CCK-IR、Glu-IR和Ins-IR细胞的形态学研究
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[摘要] 目的：观察发育中小鼠胰腺内的cck-ir、glu-ir和ins-ir细胞的形态学变化。方法：用免疫组织化学S-P法观察胚胎11 d至出生后45 d小鼠胰腺内的CCK-IR、Glu-IR 和Ins-IR细胞的发生、分布、形态和数量变化。结果：Glu-IR、CCK-IR和Ins-IR细胞均在胚胎12 d开始出现。CCK-IR细胞和Glu-IR细胞主要位于胰腺的胰岛内，但在外分泌部也可见到。Ins-IR细胞则只分布于胰腺的胰岛内。结论：三种内分泌细胞形态多样，CCK-IR细胞的数量变化与小鼠胰腺的发育相关。
[关键词] 小鼠；胰腺；CCK-IR细胞；Glu-IR细胞；Ins-IR细胞；免疫组织化学
[中图分类号] R32[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）05（c）-013-03
Cholecystokinin, glucagon and insulin immunoreactive cells in the pancreas of developing mouse
ZHAI Xiao-yan,WANG Tong**,LI Ya-qin,JING Ya,SHI Liang
(Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China)
[Abstract] Objective:To observe CCK-IR cells, Glu-IR cells and Ins-IR cells in the pancreas of developing mouse. Methods:The sections of mouse pancreas from E11 to 45th days after birth were stained with immunohistochemical S-P method to show the ontogeny, distribution and morphological characteristics of CCK-IR cells, Glu-IR cells and Ins-IR cells. Results: CCK-IR cells，Glu-IR cells and Ins-IR cells couldbe found in the mouse pancreas as early as E12. CCK-IR cells and Glu-IR cells mainly located in the pancreatic islets, and they could also be found in the exocrine portion of the pancreas. Ins-IR cells located in the pancreatic islets only. Conclusion:The three types of endocrine cells are different in shape, the population changes of CCK-IR cells concern with development of the mouse pancreas.
[Key words] Mouse；Pancreas; CCK-IR cells; Glu-IR cells; Ins-IR cells; Immunohistochemistry
胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）是一种广泛分布于中枢神经系统、周围神经系统和消化系统中的脑肠肽[1]，在消化系统，它不但对胃肠运动、胆囊收缩、胃液和胰液的分泌、摄食等起重要的调节作用，还与胆石症、糖尿病、肠癌、胰腺癌等的发病机制有关[1~5]。近来有报道，CCK在胰腺的发生、分化和再生过程中也起一定的促进作用[6~10]，但关于这方面的基础研究仅见于国外少量报道，本实验拟从形态学的角度，对CCK在发育中小鼠胰腺中的表达，特别是CCK-IR细胞与胰岛内分泌细胞的关系进行观察，以期对糖尿病和胰腺其他疾病治疗的新思路提供基础医学实验资料。
1 材料与方法
1.1 动物取材及标本制备
取健康雌、雄昆明小鼠于下午五时合笼，次晨雌鼠有阴栓者为成功。雌鼠受孕日期记为0 d，实验动物胚胎组27只，生后组20只，共47只实验动物。胚胎组：于妊娠第11、12、13、14、15、16、17、18、19天，孕鼠经乙醚麻醉后剖腹取胎鼠，以上各时段分别取整体胚胎3只；生后组：于生后第1、7、15、30、45天各取雄性昆明小鼠4只，取材前禁食24 h，乙醚麻醉后采用颈椎脱位法处死动物，剖腹取出完整胰腺。
组织块浸入Bouin's液固定，常规脱水，透明，石蜡包埋，制成7 μm厚的连续切片，每块组织的连续切片每间隔56 μm取4片，共取5组。每组相邻切片分别裱于4张载玻片上，分别做苏木精-伊红染色；CCK-IR、Glu-IR和Ins-IR细胞做免疫组织化学染色。
1.2 S-P免疫组织化学染色
切片常规脱蜡至水，3％H2O2室温孵育1 h。正常山羊血清室温孵育1 h；兔抗人CCK-8多克隆抗体4℃孵育过夜；兔抗人胰高血糖素多克隆抗体室温孵育2 h；兔抗人胰岛素多克隆抗体4℃孵育过夜。生物素标记的羊抗兔IgG室温孵育30 min；辣根酶标记链霉卵白素室温孵育30 min，DAB显色。苏木素复染，常规脱水，透明，封片。阴性对照片以PBS代替一抗，其余步骤同上。
1.3 试剂
八肽胆囊收缩素抗体（美国Sigma公司），胰高血糖素抗体（福州迈新生物技术开发有限公司），胰岛素抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。S-P试剂盒、DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。多聚赖氨酸（武汉博士德生物工程有限公司）。
1.4 细胞计数
对发育中小鼠胰腺中的CCK-IR、Glu-IR和Ins-IR细胞进行计数。每组织块计数5张非连续切片，生后组每张切片于阳性细胞密集处观察4个高倍视野（×400），每个年龄组共计80个高倍镜视野；胚胎组每张切片观察2个高倍视野，分别计数每视野中阳性细胞的数量，每个年龄组共计30个高倍镜视野。
1.5统计学方法
用SPSS14.0软件处理，数据以(x±s)表示，然后对每组数据进行平方根反正弦转换，应用SNK法或Dunnett'T3法，对不同时段胰腺中的阳性细胞数量进行单因素方差分析，P
2结果
用S-P法所显示的CCK-IR、Glu-IR和Ins-IR细胞，胞质内含棕色颗粒，背景清晰，对照片为阴性。
2.1 胰腺的发育
小鼠胚胎第11天，尚不能清晰地辨认胰腺组织。第12天，胰腺表面被覆薄层结缔组织被膜，内部可见大量间充质组织，初步可以分辨内、外分泌部（图1）。至胚胎第15、16天，胰腺外分泌部浆液性腺泡的数量逐渐增多，并可见导管穿行于胰岛中，胰岛明晰可辨，其数量逐渐增多，体积增大。第17~19天，胰腺的内、外分泌部分继续发育。生后小鼠胰腺的实质被结缔组织分成小叶，至生后30 d和45 d组，小鼠胰腺充分发育，但在生后30 d组，仍可见导管在胰岛中穿行，至生后45 d组，外分泌部的导管则只见于腺泡之间，或位于胰岛附近。
2.2 CCK-IR细胞的形态、分布
小鼠胚胎12 d，胰腺组织中出现CCK-IR细胞，细胞聚集，多为浅染（图2）。而后，随胰腺的逐渐发育成熟CCK-IR细胞逐渐分散，大部分位于胰岛中，染色深浅不一，在外分泌部的腺泡上皮和导管上皮间偶可见CCK-IR细胞（图3）。胰岛内的CCK-IR细胞形态多样，多数细胞呈圆形、椭圆形，也可见锥体形或不规则形。
2.3 Glu-IR细胞的形态、分布
小鼠胚胎期第12天，胰腺中出现Glu-IR细胞（图4）。此后至胚胎15 d，Glu-IR细胞主要散布于胰岛中。胚胎16 d后，Glu-IR细胞分布逐渐移向胰岛的周边，到胚胎18 d时则位置基本稳定（图5）。在外分泌部的导管上皮或腺泡上皮之间，也可见染色深浅不一的Glu-IR细胞。Glu-IR细胞的形态与CCK-IR细胞的形态相似，细胞的突起可以伸到胰岛内分泌细胞之间，也可以伸向到胰岛周围的外分泌部。
2.4 Ins-IR细胞的形态、分布
小鼠胰腺中的Ins-IR细胞，最早见于胚胎第12天，此后直至发育成熟，胰腺中均可见到Ins-IR细胞。Ins-IR细胞分布在胰岛的中央，外分泌部中未见Ins-IR细胞（图6）。胰腺中的Ins-IR细胞着色深浅不一，形态主要以圆形、椭圆形为主。
2.5 在胰腺生长发育中CCK-IR、Glu-IR和Ins-IR细胞数量的变化
由表1和图1可见，从胚胎12 d开始，小鼠胰腺中的CCK-IR细胞数量逐渐增多，至胚胎15 d时达高峰，胚胎16 d~生后7 d，CCK-IR细胞数量又呈减少趋势，出生后7 d直至成熟期，胰腺中的CCK-IR细胞基本消失；从胚胎11~18 d，小鼠胰腺中Glu-IR细胞的数量持续增多，胚胎第19天~生后7 d，细胞数量呈减少趋势，随后直至生后成熟期，Glu-IR细胞的数量又再次显著性增多；从胚胎第12天起，整个胚胎期小鼠胰腺中的Ins-IR细胞的数量持续增多，尤以胚胎19 d组明显。生后7 d组Ins-IR细胞数量减少，此后直至发育成熟，Ins-IR细胞的数量再次显著性增多。
对各组数据进行平方根反正弦转换后，组间方差分析表明，胚胎12~15 d，三种细胞的数量有显著性差异（均P＜0.05）；胚胎16 d~生后7 d，CCK-IR细胞数量与Glu-IR比较，差异有显著性（均P＜0.01）；与Ins-IR比较，差异有显著性（均P＜0.01）；胚胎19 d~生后45 d，Glu-IR与Ins-IR细胞数比较，差异有显著性（P＜0.05）。
由图7可见，CCK-IR细胞与胰腺胚胎期的发育有密切关系。
3 讨论
胆囊收缩素（cholecystokinin,CCK）是一种广泛分布于胃肠道及中枢神经系统的脑肠肽，它对于胃肠运动、胆囊收缩、胃液和胰液的分泌以及摄食等都起着非常重要的调节作用[1~5]。近来国外有少量研究报道，CCK对胰腺发育、分化、再生亦有促进作用[6~10]，但国内尚未见到这方面的基础研究报道。关于促进胰腺发育分化，调节胰腺功能活动的CCK的来源研究尚无定论。经典理论认为，血浆中的CCK来源于小肠上段的CCK-IR细胞[1，11]。但也有研究报道，在发育中某些动物的胰腺中有CCK-IR细胞出现[6，8]。Liu等[6]报道，小鼠胚胎第16天，胰腺外分泌部的腺泡处出现CCK-IR细胞，出生后随胰腺生长，CCK在胰岛中的表达逐渐增强[6，8]。本研究观察中发现，小鼠胰腺中的CCK-IR细胞出现于胚胎第12天，至胚胎第15天细胞数量达高峰，此时胰腺也正处于明显分化阶段。胚胎第16天后CCK-IR细胞数量逐渐减少，出生后在胰腺中仅偶见CCK-IR细胞，这与Liu等[6]报道的CCK在出生后胰腺中的表达逐渐增强明显不同。据此推测，小鼠胚胎期胰腺内表达的CCK,其作用可能主要是刺激胰腺的生长、分化。生后调节胰腺分泌作用的CCK则可能来源于小肠上段的CCK-IR细胞。
观察发育中小鼠胰腺中的CCK-IR、Glu-IR和Ins-IR细胞的数量变化，我们发现，在小鼠出生前，CCK-IR细胞数量逐渐减少，至小鼠出生后7 d几乎消失，说明CCK-IR细胞与胚胎期小鼠的胰腺发育关系密切，而GLU-IR细胞和Ins-IR细胞的数量在生后7 d组也有下降趋势，可能与失去CCK的刺激有关。出生后15 d左右小鼠断奶，改喂富含碳水化合物的固体饲料，此后，小鼠胰腺中Glu-IR细胞和Ins-IR细胞数量的明显增多可能与小鼠摄食内容的改变和血糖水平调节的需要有关。
胰腺的外分泌部和胰岛均来源于胚胎期内胚层原始消化管的前肠，目前，人们试图分离胰腺外分泌部的导管上皮，经体外培养分化为胰岛内分泌细胞，以解决胰岛移植的供体来源[13]。本实验研究了胰腺生长发育过程中CCK-IR、Glu-IR和Ins-IR细胞数量变化的关系，以期为进一步研究胰岛移植的供体来源问题提供参考。
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（收稿日期：2008-03-11）
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