波棱素脂质体的制备工艺及处方优化研究
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[摘要]波棱素是波棱瓜子中的木脂素分离出来的活性单体成分，其具有抗肝损伤、抑制乙型肝炎病毒复制的作用。该实验首次采用薄膜分散法成功制备了波棱素脂质体，以包封率为指标，对处方工艺进行优化。优化后的最佳膜材处方为波棱素-大豆磷脂-胆固醇 2.44∶78.05∶19.51，选用0.5%普流尼克（F68）溶液50 ℃下进行水合脱膜，并水浴超声时间20 min，制备得到的波棱素脂质体平均包封率为（94.50±2.15）%，粒径（119.2±10.7） nm，达到试验预期，这将为后期的肝靶向给药系统的研究奠定基础。
波棱瓜子系葫芦科波棱瓜属植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall.的干燥成熟种子[1]。它是常用的藏药，主治肝炎、胆囊炎等疾病，亦有治疗消化不良、清热解毒之功效[2-3]。波棱素（herpetin， HPT）是波棱瓜子中的木脂素分离出来的活性单体成分，药理学活性研究表明，其具有抗肝损伤、保肝降酶、抑制乙型肝炎病毒复制的作用[4]。HPT在水中的溶解度很低（≈0.1 g・L-1），为了增加HPT溶解度并提高其肝脏靶向性，本研究将HPT制成脂质体并优化了制备工艺，为后期研究奠定基础。
1 材料
Acquity型超高效液相色谱（美国Waters公司）；JEM-100CX透射电子显微镜（日本JEOL公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度及电位分析仪（英国Malvern公司）；BS210S电子天平（德国Sartorius公司）。波棱素对照品（自制，纯度98.59%）；波棱素结晶（自制，纯度>95%）；大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂（德国Lipoid公司）；胆固醇（美国Sigma公司）；0.5 mL超滤离心管（10 kDa）（Millpore公司）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 HPT脂质体包封率的测定
2.1.1 色谱条件 采用UPLC测定样品HPT的含量，计算脂质体的包封率。色谱条件如下：采用C18 BEH色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相乙腈-2%冰醋酸（24∶76）[5]，流速0.6 mL・min-1，柱温30 ℃，检测波长280 nm，进样体积5 μL。色谱图见图1。
2.1.2 线性范围 精密称取HPT对照品适量，加入甲醇超声溶解，定容得到1.00 g・L-1的对照品储备液。精密量取储备液适量，分别置于量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，配置得到质量浓度分别为2.0，4.0，10.0，20.0，40.0，100.0 mg・L-1的工作液，采用UPLC分析，测定峰面积值。将峰面积（Y）和浓度（X）进行回归，得到回归方程Y=10 976X-22 391，r=0.999 9，HPT在2.0～100.0 mg・L-1线性关系良好。
2.1.3 回收率及精密度试验 精密量取已知含量的样品溶液9份，分别加入高、中、低3种浓度的HPT对照品溶液，经过测定，平均回收率分别为102%，99.5%，96.8%，日内精密度RSD 2.3%，日间精密度RSD 4.6%。
2.2 超滤法测定包封率
2.2.1 超滤法对空白脂质体的回收率 取空白脂质体溶液适量，经超滤离心后收集滤液，用定磷法测定磷含量。结果未检测到磷，说明脂质体全部被截留。
2.2.2 超滤法对游离药物的回收率 分别取HPT对照品溶液4.0，20.0，80.0 mL经超滤离心后，测定滤液中的HPT含量，计算回收率。结果显示回收率均大于95%，说明超滤膜对HPT几乎无吸附作用。
2.2.3 超滤法测定脂质体包封率 量取HPT脂质体溶液0.5 mL，置于Millpore超滤管中，4 000 r・min-1离心10 min后收集滤液，按2.1.1项下方法测定峰面积，用外标一点法计算HPT含量，记为W1；另精密量取HPT脂质体溶液0.5 mL，加入甲醇超声10 min后定容，摇匀，同法测定HPT含量，计为W2，根据下列公式计算包封率：包封率（EE）=（1-W1/W2）×100%。
2.3 HPT脂质体制备方法的选择
以HPT脂质体的稳定性、粒径大小及包封率为指标，按照相同的处方量，分别按照薄膜分散法、注入法、逆相蒸发法制备脂质体，筛选适宜的制备方法。结果见表1，综合考虑HPT脂质体的稳定性、粒径大小及包封率，最终选择薄膜分散法制备HPT脂质体。
2.4 均匀设计优选HPT脂质体膜材处方
处方以大豆磷脂、胆固醇、HPT 3种成分组成，以三者在其变量范围内的百分含量作自变量，分别设为X1，X2和X3，以HPT脂质体的包封率为指标，采用带约束的混料均匀设计，进行处方优化。以预实验结果为参考，制定如下约束条件：①60%≤X1≤89%，10%≤X2≤20%，1%≤X3≤20%；②X1+X2+X3=100%。采用UD3.0均匀设计软件，设计U9（93）表进行试验，见表2。
对实验结果进行分析，得到方程Y=67.2-16.5X1X1+184.96X1X2+506.25X1X3-436.81X2X3-2 784.6X3X3，显著性水平α=0.05，检验值Ft=29.37，临界值F（5，3）=9.01，回归方程显著。根据回归方程，得出优化实验处方为：大豆磷脂用量78.05%，胆固醇19.51%，HPT 2.44%。
2.5 HPT脂质体的制备
根据上述筛选条件，采用薄膜分散法制备HPT。按照均匀设计优选的处方比例，称取HPT 24.4 mg，大豆磷脂780.5 mg和胆固醇195.1 mg，溶于100 mL氯仿中，转入1 L磨口圆底烧瓶中，30 ℃水浴减压除去氯仿，使成膜材料在瓶底部形成一均匀类脂膜。然后加入一定浓度的F68溶液50 mL，在50 ℃下旋转蒸发仪转动洗膜30 min，将类脂膜洗脱并水合成脂质体初悬液，水浴超声，过0.22 μm滤膜，即得HPT脂质体。
2.5.1 普流尼克（F68）用量对脂质体包封率的影响 按2.4项下方法制备HPT脂质体，固定其他辅料用量，考察不同F68用量对HPT脂质体包封率的影响。分别选择F68溶液浓度为0.2%，0.5%，1.0%，2.0%进行试验。结果见表3，随着F68溶液浓度增加到0.5%时，HPT脂质体包封率达到稳定，故选用0.5% F68溶液进行水合。
2.5.2 超声时间对脂质体包封率的影响 按2.4项下方法制备HPT脂质体，考察不同超声时间对HPT脂质体包封率的影响。分别选择水浴超声5，10，20，30 min进行试验。结果见表4，随着水浴超声时间延长，HPT脂质体包封率逐渐增加，水浴超声20 min后，包封率无显著增加，故选用水浴超声20 min。
2.5.3 优化的制备工艺 称取HPT，大豆磷脂和胆固醇，溶于100 mL氯仿中，转入1 L磨口圆底烧瓶中，30 ℃水浴减压除去氯仿，使成膜材料在瓶底部形成一均匀类脂膜。然后加入0.5% F68溶液50 mL，在50 ℃下旋转蒸发仪转动洗膜30 min，将类脂膜洗脱并水合成脂质体初悬液，水浴超声20 min，过0.22 μm滤膜，即得HPT脂质体。3批HPT脂质体的平均包封率为（94.50±2.15）%，平均粒径为（119.2±10.7）nm，多分散系数为0.156±0.075。
2.5.4 脂质体的形态观察 取优化工艺条件下制备的HPT脂质体溶液，将稀释到一定浓度的脂质体溶液滴至专用铜网上，用4%磷钨酸溶液负染30 s[6]，自然晾干后，用透射电子显微镜观察粒子的形态，见图2。所制备的HPT脂质体为近球状小囊泡，形态圆整。
3 讨论
目前国内对波棱素的研究仍处于起步阶段，相关的波棱素制剂研究更是鲜有报道。本研究首次报道了波棱素脂质体制备方法，并系统研究了影响波棱素脂质体包封率的主要因素：①制备方法的选择较为关键，为了得到粒径较小、包封率高、分散均一的脂质体，筛选结果显示薄膜分散法能获得预期的效果；②带约束的混料均匀设计是常用的处方优化实验方法，每个因素的贡献被表示为其在处方中所占配比，并进行边界约束，所有因素总和为100%，通过试验求出可以计算和推测最佳混料比[6-7]，从本研究的均匀设计结果可知，HPT用量以及大豆磷脂用量是比较关键的，直接影响脂质体的包封率高低，胆固醇用量的影响并不显著；③在脂质体制备中，脱膜和水合过程中加入0.5% F68水溶液，有利于脂质体的稳定及提高包封率，F68结构中的高分子链自由舒展，可在油水界面与磷脂形成复合凝聚膜，增加界面膜的柔韧性，同时，其亲水性良好的聚氧乙烯链可部分吸附在乳滴表面，产生较大的空间位阻，阻止乳滴的聚合，使脂质体更加稳定[8]。本研究也尝试过仅加入PBS溶液或者蒸馏水进行脱膜和水合，均不如F68水溶液的效果理想。本研究通过制备波棱素脂质体，大幅地提高了波棱素的溶解性，为后续研究奠定了基础。今后的研究中将着重考察波棱素脂质体的体内肝靶向性以及药效作用。
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Study on preparation process and formulation
optimization of herpetin liposomes
ZHANG Xin TAN Rui GU Jian HE Li-li FAN Li-na NAN Xing-mei1
（1.Ethinic Medicine Research Institute， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China；
2.Life Science and Engineering College， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China）
[Abstract] Herpetin （HPT） is an active monomer constituent isolated from lignanoid in seeds of Herpetospermum caudigerum. HPT shows inhibitory effects in hepatic injury and HBV-DNA and the replication. In the study， we successfully prepare herpetin liposomes by film dispersion method for the first time. The prescription process was optimized， with the entrapment efficiency as the index. According to the optimized prescription， the mass ratio of HPT： phospholipids： cholesterol was 2.44∶78.05∶19.51， the hydration and de-molding process was performed with 0.5% F68 solution at 50 ℃， and the water-bath ultrasonic time was 20 min. The HPT liposomes prepared by this method showed an average entrapment efficiency of （94.50±2.15）% and a particle size of （119.2±10.7） nm， which was consistent with the trial expectations and will lay a solid foundation for the hepatic targeting delivery system in future.
[Key words] herpetin； liposome； preparation process； prescription optimization
doi：10.4268/cjcmm20140610