波棱素脂质体冻干粉针的制备及初步安全性和药效学研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇波棱素脂质体冻干粉针的制备及初步安全性和药效学研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

[收稿日期] 2014-05-17

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81674168）；四川省科学支撑项目（2011FZ0053）；四川省应用基础研究项目（2012JY0027）

[通信作者] *顾健，教授，研究生导师，主要从事中药及民族药物开发与研究，Tel：13882156288， E-mail：

[作者简介] 张鑫，硕士研究生，E-mail：

[摘要] 该文研究了波棱素（herpetin， HPT）脂质体冻干粉针剂的制备方法，并对其初步安全性和药效学进行评价。采用薄膜分散法制备HPT脂质体溶液，以包封率、粒径等为评价指标，筛选最佳冻干保护剂；对冻干粉针进行稳定影响因素实验，并初步研究了HPT脂质体冻干粉针的安全性以及对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果。质量分数5%乳糖+5%蔗糖为最佳冻干保护剂，按照最优处方制得的脂质体冻干粉针复水后，平均包封率为（99.70±0.50）%，平均粒径为（107.0±1.2） nm，平均电位为（-6.11±0.72）；脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均较为敏感；脂质体冻干粉针复水后不会引起溶血和红细胞聚集反应，静脉注射对血管亦无明显影响；HPT脂质体对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果明显，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）指标水平均明显改善，治疗效果明显优于HPT原药。按照最优处方制备的波棱素脂质体冻干粉复水后粒径均匀，包封率符合《中国药典》要求，且具有较高的安全性，能显著提高HPT的治疗效果，保存时应该注意低温、避光、密封保存。

[关键词] 波棱素；脂质体；粉针剂；安全性；药效学

波棱素（herpetin， HPT）是从藏药波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall.子中的木脂素分离出来的活性单体成分。药理学活性研究表明，其具有抗肝损伤、保肝降酶、抑制乙型肝炎病毒复制的作用[1]。但HPT的水溶性很差，口服生物利用度低，为了克服HPT的上述缺点，并增强其治疗肝脏疾病的效果，作者在前期研究中利用薄膜蒸发法制备HPT脂质体。本研究进一步对HPT脂质体冻干粉针制剂进行筛选，并初步考察了HPT脂质体冻干粉针的安全性及对肝损伤模型动物的治疗效果。

1 材料

Acquity型超高效液相色谱（美国，Waters）；ZS90激光粒度仪（英国，Malvern）；冷冻干燥机；LHH药品稳定性试验箱（上海一恒科学仪器有限公司）；可见分光光度计（上海箐华科技仪器有限公司）；台式高速离心机TGL-16G（无锡市瑞江分析仪器有限公司）。波棱素对照品（自制，纯度为98.59%）；波棱素原料药（自制，纯度>95%）；大豆卵磷脂购自德国Lipoid公司；胆固醇购自美国Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒购自长春汇力生物技术有限公司。超滤离心管（10 kDa）购自Millpore公司，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。

ICR小鼠，SPF级，体重18～22 g，雄性；家兔，体重1.8～2.2 kg，雄性，均购自于成都达硕实验动物研究中心，动物合格证号分别为SCXK（川）2013-24，SCXK（川）2013-14。

2 方法与结果

2.1 HPT脂质体溶液的制备

根据前期研究结果，采用薄膜分散法制备HPT脂质体溶液[2]：称取波棱素单体24.4 mg、胆固醇195.1 mg、大豆磷脂780.5 mg，置于圆底烧瓶中，加入100 mL氯仿溶解，水浴减压除去氯仿，成膜，加入0.5%泊洛沙姆F68 50 mL脱膜，将得到的类脂膜初悬液水浴超声20 min，过0.22 μm滤膜，即得HPT脂质体溶液。经测定，HPT脂质体平均包封率（94.50±2.15）%，平均粒径（119.2±10.7） nm，多分散系数为0.156±0.075。

2.2 冻干粉针处方筛选

选择常用的葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖为冻干保护剂选择不同种类、不同浓度的冻干保护剂，见表1，溶于HPT脂质体溶液中，冷冻干燥后，制得HPT脂质体冻干粉针，观察以下评价指标：①外观及色泽；②再分散性；③粒径；④包封率，筛选出适合的冻干保护剂。选择5%乳糖+5%蔗糖作为复合冻干保护剂，HPT脂质体复水后，粒径最小，包封率最高，外观和再分散性也较好，故选择5%乳糖+5%蔗糖作为HPT脂质体的冻干保护剂。

2.3 初步稳定性研究

取HPT脂质体冻干粉针样品进行影响因素实验考察，分别选取①高温试验条件：40 ℃；②高湿试验条件：相对湿度（RH）75%；③光照试验条件：4 500 lx的光照。将冻干粉针样品分别放置上述条件下，于第5，10天取出样品，观察HPT脂质体冻干粉针变化情况，测定渗漏率，见表2，在40 ℃条件下放置后，HPT脂质体冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率增加，含量略降低；在相对湿度75%的高湿条件下放置后，HPT脂质体冻干粉针外观塌陷，再分散困难，脂质体泄漏率增加；在强光条件下放置后，冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率亦增加，含量亦明显降低。因此，HPT脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均敏感，应低温、密封、避光保存。

2.4 溶血试验

取家兔血液10 mL置于含有枸橼酸葡萄糖抗凝的离心管中，4 000 r・min-1离心5 min，弃去上清液，下层红细胞用生理盐水洗涤3次，并按体积比用生理盐水稀释成2%红细胞混悬液。所有试管中均加入红细胞混悬液各2.5 mL，设置样品管、阴性对照试管和阳性对照试管[3]。样品管中分别加入适量HPT脂质体冻干粉针复水液及适量生理盐水，使之HPT脂质体终浓度分别为2%，4%，6%；阴性对照试管仅加入生理盐水；阳性对照试管加入蒸馏水。混匀后，立即将试管置于37 ℃恒温水浴箱水浴30 min后，取出适量样品液离心去除不溶物，于542 nm下测定各样品吸光度，计算溶血率，见表3，HPT脂质体在各个测定浓度下的溶血率均低于5%，可判断HPT脂质体无溶血作用。

2.5 全血凝血时间

取波棱素脂质体冻干粉针复水液10 μL，以等量生理盐水作为对照，加入24孔细胞培养板中。另取枸橼酸葡萄糖抗凝家兔血适量，按体积比10∶1加入0.1 mol・L-1CaCl2溶液进行活化，混匀，立即各取100 μL加入上述含有样品的培养板中，分别于5，15，25，35，45，55 min时间点加入3 mL 37 ℃预热的蒸馏水于对应的样品孔中。5 min后取出适量样品液离心去除不溶物，于542 nm下测定各样品光密度值。以吸光度为纵坐标，时间为横坐标绘制全血凝固时间曲线，见图1，HPT脂质体冻干粉针复水液样品的全血动态凝血曲线与对照组相似，可知HPT脂质体对全血凝固时间无显著影响。

2.6 血管刺激试验

取雄性家兔1只，每日右耳耳缘静脉注射HPT脂质体复水液20.0 mg・kg-1，左耳耳缘静脉注射生理盐水注射液，作为空白对照组，每天1次，连续滴注4 d。末次给药后24 h，耳缘静脉注入空气处死家兔，剪取距注射部位1.3 cm处兔耳，置于10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，HE染色。光镜下观察药物对兔耳血管的刺激性反应，结果见图2，连续注射HPT脂质体后，耳缘静脉血管内皮完整，内皮细胞结构清楚，血管腔无扩张，无坏死脱落，未见明显炎细胞浸润，可判断HPT脂质体冻干粉针对血管无刺激性。

2.7 HPT脂质体冻干粉针对四氯化碳致肝损伤的保护作用

2.7.1 动物分组造模及给药 ICR小鼠50只，雄性，18～22 g。采用随机数字法将小鼠分成5组：正常组、模型组、HPT对照组、阳性对照组、治疗组，每组10只小鼠。HPT对照组尾静脉注射20 mg・kg-1的HPT 10%甘油生理盐水溶液（相当于0.4 g・L-1的HPT）；阳性对照组尾静脉注射20 mg・kg-1清开灵注射液；治疗组尾静脉注射20 mL・kg-1的HPT脂质体原药溶液，正常组和模型组注射等体积生理盐水，均每天1次，连续给药7 d。末次给药后1 h，除空白组，其余各组腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液20 mL・kg-1，造成急性肝损伤模型[4]。

2.7.2 指标测定及评价 腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液后，禁食不禁水16 h后，摘眼球取血，血样室温静置30 min，4 ℃ 4 000 r・min-1离心10 min后，分离血清，备用。按试剂盒测定说明书分别测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）的活力，结果见表4。正常组小鼠血清中的AST，ALT，ALP活力明显低于模型组（P

3 讨论

脂质体混悬液物理化学性质不稳定，不利于储存和运输，故制备成冻干粉针。制成冻干粉针的过程中，零下的温度会造成磷脂双分子层的破裂，加入的蔗糖和乳糖属于糖类大分子，能在脂质体混悬液中形成无形的骨架，能够起到冻干保护剂的作用，从而维持磷脂双分子的稳定。但受到本身原料的限制，冻干粉针也不能长时间处于高温、高湿和光照的环境。初步安全性实验结果表明，波棱素脂质体冻干粉针未造成家兔的溶血和凝血，对注射部位也没有明显的刺激反应。因此，所制备的波棱素脂质体冻干粉是安全可靠的，为今后可能的临床应用奠定了安全数据基础。

ALT，AST和ALP是自身免疫活性酶，主要存在于心肌、肝脏，血液中含量很低，当肝脏受到破坏时，才会在血液中急剧上升。CCl4致急性肝损伤是一种肝脏造模的经典方法，其原理在于CCl4其强氧化的自由基破坏肝脏细胞膜，从而导致其中的ALT，AST和ALP从肝脏流入血液。本实验结果表明HPT脂质体能较阳性组和HPT原药组，显著降低小鼠血清中ALT，AST和ALP水平，这表明其对肝损伤有明显的保护作用。这应该与脂质体制剂本身具有肝脏靶向性有关，能够富集HPT在肝脏部位，增强HPT清除强氧化自由基的效果。本研究为HPT脂质体保护急性肝损伤疾病提供实验依据，具有临床指导意义。

[参考文献]

[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准（藏药）.第1册[S]. 北京：中国医药科技出版社，1995：64.

[2] 张鑫，谭睿，顾健，等.波棱素脂质体的制备工艺及处方优化研究[J]. 中国中药杂志， 2014， 39（6）： 1007.

[3] 陈奇. 中药药理研究方法学[M]. 北京： 人民卫生出版社， 1996： 168.

[4] 冀润利，赵青娥. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用[J]. 中国应用生理学杂志， 2012， 28（3）： 279.