p27Kip1与肿瘤
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真核生物的细胞周期进程是由一系列调控因子有序的聚合和激活来调节控制的,其正常与否和细胞以及个体的生长、分化、衰老和癌变密切相关。参与细胞周期调控的主要分子有：细胞周期蛋白（cyclin），细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和CDK抑制蛋白（cyclin dependent kinase inhibitors，CDKI）。其中CDKI通过与细胞周期蛋白，CDK或细胞周期蛋白-CDK复合物的结合,抑制CDK的活性，导致细胞周期停止，阻断细胞的增殖过程。目前发现的CDKI按结构和功能的不同分成两大类：一类为Ink4（Inhibitor of cdk4）,包括p16 、p15、p18和p19，其蛋白质结构均具有4个回钩状重复序列，特异性抑制细胞周期蛋白D-CDK4/CDK6的磷酸化激酶活性。另一类为Cip/Kip (CDK-interacting protein/kinase inhibition protein),包括p21 Cip1、p27 Kip1、p57 Kip 2等。它们在C-末端有一核定位信号，并在近氨基末端有一保守区。这一组蛋白可广泛作用于各种细胞周期蛋白-CDK复合物，发挥其抑制活性。由于CDKI的生物化学功能及其调节方式，决定了它们在细胞生长的重要阶段中具有重要的作用。作为CDK的抑制蛋白，已证明一些CDKI是潜在的肿瘤抑制因子或抑癌基因。近年来所发现的p27基因及其产物对于细胞的生长有着极其重要的调控作用，并且在某些肿瘤组织和肿瘤细胞株中发现p27表达的异常，提示其与肿瘤的发生发展有着密切的关系。
一、 p27kip1基因及其蛋白
1994年，Polyak等［1］在转化生长因子-β（TGF-β）和经细胞接触处理的生长抑制细胞中发现了一种相对分子质量为27 000的热稳定蛋白。这种物质在体外与细胞周期蛋白E-CDK2和细胞周期蛋白D-CDK4紧密结合，并以一种化学剂量的关系抑制CDK的活性，因此被称为p27 Kip1（p27或kip1）。体内实验也发现了p27能与细胞周期蛋白E-CDK2结合，发挥其抑制效应［2］。p27基因定位于人12号杂色体的12p12.0～12p13.1交界处，含有两个参与编码的外显子，能编码一个198氨基酸的多肽，另有一个无编码功能的外显子3和一个大约600bp的内含子。外显子和内含子之间的连接符合一般的规律，即“GT-AG”相连［3，4］。p27 mRNA的长度为2.5 kp。1994年Polyak克隆出了p27蛋白的cDNA。用Mv1Lu细胞系确定的p27 cDNA探针筛选人类肾脏和小鼠胸腺来源的cDNA文库，得到了高度相关序列的克隆。人类和小鼠的cDNA分别具有594 bp和591 bp的开放阅读框架，在进行初始翻译的适当位置有一ATG起始密码子，翻译结束有一终止信号。
p27蛋白在人、貂、鼠中具有高度保守性。在N-末端与p21蛋白具有42%的同源性，与p57有47%的同源性。这一区域28-87位的60个氨基酸具有两个Ser磷酸化位点，介导CDK激酶活性的抑制，153-169位的17个氨基酸序列为核定位序列，该序列在Kip的3个成员中均存在。p27的C-末端有一个Thr磷酸化位点，与其H1组蛋白磷酸化抑制作用有关［2］。在动物实验中发现，几乎各种组织均表达p27蛋白，定位于细胞核。通常在非增生性细胞中出现p27蛋白表达，例如肠道中，位于微绒毛中间和顶部的静止期细胞出现p27阳性表达，而在增生的基底细胞p27表达则罕见。细胞周期中，p27蛋白水平在静止期细胞最高，受到促有丝分裂源刺激后开始下降，当DNA合成达到最高点，p27蛋白降到最低水平，随着细胞周期的完成，p27开始重新聚积，细胞重新进入静止状态［5］。
二、p27Kip1的调节及作用机理
p27蛋白具有限制性调节细胞周期进程的作用，这一作用主要通过抑制CDK复合物的功能来实现。虽然p27能广泛抑制各种周期素和CDK的活性，但主要抑制细胞周期蛋白E-CDK2和细胞周期蛋白D-CDK4等G1期激酶复合物，使细胞不能通过G1期。p27对CDK的抑制主要有两个方面，一方面通过其C-末端抑制Cdk2-Thr1 60的磷酸化，从而抑制细胞周期蛋白-CDK2前活性状态复合物的激活过程。另一方面通过直接与细胞周期蛋白-CDK结合抑制已激活的复合物的激酶活性［2］。
大量体外实验证明，p27在介导胞外信号尤其是负性信号的传导中起着极其重要的作用。在TGF-β、接触抑制及多种外源性细胞生长抑制因子处理的细胞系中，p27蛋白表达量增加，使细胞通过限制点最关键的细胞周期蛋白E-CDK2复合物的活性受到抑制，从而使细胞周期停滞在G1期，细胞生长停止［6，7］。研究发现，TGF-β处理前后的细胞内p27的mRNA量无明显变化，但细胞内可获得的游离的p27蛋白量增加，这种实际有效数量的释放可能是抑制细胞周期的关键因素。TGF-β一方面通过抑制CDK4的合成而减少G1中期细胞内形成的细胞周期蛋白D1-CDK4-p27三元复合物，从而使细胞内可利用的、游离的p27相对增加，使p27能有效地抑制G1后期的细胞周期蛋白E-CDK2的复合物活性。同时，CDK4水平的下降也可通过抑制Rb的磷酸化，阻止转录因子E2F的释放，从而抑制DNA的合成。另一方面，TGF-β可能通过抑制细胞周期蛋白E的表达而减少G1末期细胞内细胞周期蛋白E-CDK2的浓度，使细胞内原有的p27 量足以结合细胞周期蛋白E-CDK2，将其浓度降低到促进细胞增殖的阈值以下而抑制细胞周期［2］。Kato等［8］用cAMP处理巨噬细胞后，发现p27合成增加2-3倍，细胞停滞在G1期。另外，Peng等［7］报道了在用抗上皮生长因子受体处理的细胞系中，p27mRNA水平增高，以至p27蛋白合成增加，CDK2活性受抑制，提示在抗增殖信号的作用下，p27翻译的快速增长对于G1期进程的负性调节也是一个不可忽视的方面。
此外，p27还与正性生长调控因子有关。在血小板源性生长因子处理的BALB/C3T3细胞系中，发现p27的合成受到抑制。在有丝分裂促进因子白介素-2（IL-2）处理的T细胞中，游离的p27的量明显减少，细胞周期蛋白-CDK2复合物的活性增加，细胞由G1期进入S期［6］。Mal等［9］在TGF-β处理的MvlLu细胞中发现病毒E1A癌蛋白能直接与p27结合，阻止其抑制效应，恢复细胞周期蛋白E/A-CDK2复合物的活性，促进细胞周期中G1-S期的转换。就目前所知，EIA是第一种能使CDKI功能失活的癌蛋白。值得一提的是，p27缺乏的小鼠可发生垂体肿瘤，并且出现身体增大，多器官增生，视网膜发育异常 ，卵巢滤泡的形成减弱，雌性小鼠不孕等现象［5］，提示p27可能部分地参与了细胞停止分裂和启动细胞分化的作用。
三、p27Kip1与肿瘤的关系
p27负性调节细胞增生的生物学功能提示它可能作为一种肿瘤抑制物，成为一个候选的肿瘤抑制基因［2，3，10］。实验发现，p27在白细胞中的表达可以抑制细胞从静止期向增生期的转化，它在染色体上的位置通常在白血病中发生缺失［6］。Kawamata等［4］运用Southern杂交和聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）检查了432例人类各种恶性肿瘤及20例癌细胞系的p27基因改变，仅发现1例第109位密码子的多态性，和1例沉默突变。其余均无基因的缺失，重排和突变。Ponce-Castaneda等［3］普查了人类147例原发实体瘤，也得到了同样的结果，说明p27基因的异常在人类肿瘤中属罕见事件。Cheng等［10］报道，当外源p27转染星形瘤细胞株并获得过度表达时，能够抑制瘤细胞株的恶性表型和减少非整倍体细胞的积聚。Lioyd等［11］也发现像间变型甲状腺癌之类的高度恶性肿瘤与其正常的甲状腺和良性腺瘤相比，p27的蛋白水平下降。这些结果均提示p27表达可能与肿瘤的发生发展密切相关。
1．内分泌肿瘤：Lioyd等［11］运用免疫印迹和免疫组化方法观察了177例人体各种组织的p27表达情况，其中包括垂体、甲状旁腺、甲状腺、胰腺和肾上腺等内分泌肿瘤。发现在相应正常组织中有丰富的p27蛋白表达，但在内分泌性腺瘤和癌中，p27表达下降。例如，正常的甲状腺和甲状旁腺组织中可见p27蛋白呈高表达，相应的腺瘤比癌又有更多的p27阳性细胞。另外发现，ki-67标记对于甲状旁腺增生和腺瘤无明显区别，而增生性甲状旁腺p27表达阳性细胞数比甲状旁腺腺瘤高出3倍之多，提示对于区别困难的甲状旁腺增生和腺瘤，p27免疫组化染色有助于鉴别诊断。肾上腺成神经节细胞瘤， p27阳性细胞数比神经母细胞瘤高出几乎2倍。Jin等［12］研 究了30例甲醛固定，石蜡包埋的垂体腺瘤组织、8例已确定有转移的原发性垂体癌，以及4例非肿瘤性垂体，结果显示80%的正常垂体细胞核表达p27蛋白，而在腺瘤和癌中则有显著的下降。相反，ki-67标记在非肿瘤性垂体中几乎检测不到(0.2%)，但在垂体癌中则显著增高。这些结果支持体外细胞株检查即在静止期细胞中，p27呈高水平表达，随着增生活性的增加p27蛋白水平下降。同时作者运用逆转录多聚酶链式反应、Northern杂交和原位杂交分析非肿瘤性垂体和垂体肿瘤，发现p27 mRNA水平不像p27蛋白，两者间无显著差别，提示在垂体中p27水平的控制是通过翻译或翻译后机制进行的。
2． 乳腺癌：过去对直径＜1 cm(T1a,b)的浸润性乳腺癌缺乏一定的预后判断指标，术后是否需要作腋窝淋巴结清扫或辅助治疗尚有争议。Tan等［13］分析了202例T1a,b浸润性乳腺癌，发现p53、MVO、 ki-67/MIB-1,以及c-erbB-2等与生存率并无显著相关，而p27表达水平和淋巴结转移则与乳腺癌生存率显著相关。肿瘤中有p27高表达的病人其中位生存时间为174个月，而p27表达较低的病人中位生存时间为139个月，p27表达的高低在淋巴结转移阳性与阴性组病人中无明显差异。但在有淋巴结转移的病例，p27表达高低与生存率仍有显著差别，甚至在有腋窝淋巴结切除但无转移的病人中，p27呈低表达的有14%的死亡率，相比之下，p27高表达的死亡率为8%。作者认为，虽然淋巴结转移与预后不佳有显著关系，但这些病人仅代表了人群中的一小部分。对p27蛋白表达检测的意义在于能够鉴定无淋巴结转移但预后较差的病人。p27低表达与生存率下降相关。因此，p27可成为判断乳腺癌的一个新的独立的预后指标，有助于鉴定小的浸润性乳腺癌，并指导辅助治疗。Spirin等［14］研究了36例原发性乳腺癌的基因改变，仅发现1例沉默突变，并无氨基酸的改变；另1例为无义突变，在密码子104处核苷酸替换(CAGTAG)形成了一个终止密码，通过mRNA翻译，出现一种截短的无功能的p27蛋白表达，原有的C-末端区域即核定位信号丢失，这一改变可能与乳腺癌的发生发展有关。
3．消化系统肿瘤：Loda等［15］发现在大肠癌中，p27蛋白表达低或缺乏时，针对p27的蛋白水解酶活性增加，提示p27表达下降可能是由于逐渐增加的蛋白酶所介导的降解作用所致，而非基因改变。并且，在肿瘤细胞中有p27表达的病人，其中位生存时间为151个月,而p27表达缺乏的肿瘤病人生存期仅69个月，经多变量分析,认为p27对于大肠癌尤其是Ⅱ期肿瘤是一个强有力的独立预后指标。Yasui等［16］在研究p27 Kip1表达与胃癌之间关系时，发现p27阳性率的降低与胃癌的进展期、肿瘤浸润的深度以及淋巴结转移有显著的相关。提示p27蛋白的减少可能反映了胃癌的进展情况，并可能作为一个恶性程度高的指征。
4． 淋巴造血系统肿瘤：Morosetti等［17］对74例人类非霍奇金淋巴瘤，42例成人T细胞性白血病的p27基因分析显示无明显的突变。仅少数病例出现无义突变，导致截短的无功能的p27蛋白表达，另外在2例淋巴瘤中发现有p27基因的纯合缺失。提示p27基因改变在恶性肿瘤中属罕见事件，但少数病例的异常改变可能在这些肿瘤的发展中起一定的作用。免疫组化发现淋巴瘤中p27蛋白表达明显低于正常淋巴组织［11］。
5． 其它：对肺癌、前列腺癌等的研究也发现，p27蛋白表达在正常组织和肿瘤中有一定的差异［11］。Esposito等［18］研究的108例非小细胞性肺癌，以及Tsihlias等［19］研究的113例前列腺癌，均发现p27蛋白的低表达与复发及预后差有关。但肝脏和软骨组织中则出现了相反的趋势，即肝癌和软骨肉瘤呈p27高表达，而相应的正常组织则表达较低，这可能与组织特异性有一定的关系［11］。
上述研究结果表明，p27 Kip1蛋白是细胞周期负性调节物，抑制细胞增殖，阻断细胞生长于G1期。p27基因改变在许多人类恶性肿瘤中属罕见事件，但在良、恶性肿瘤中却广泛存在p27表达异常，提示一种翻译或翻译后的水平调控机制。人们对p27的研究才刚刚开始，很多问题尚需进一步的研究，如p27在活体作为生长调节因子的功能，p27在肿瘤抑制途径中的功能等等。对p27的研究，有助于深入了解肿瘤的发生发展机制，并可为进行鉴别诊断，判断预后，基因治疗提供一定的依 据。
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