羽毛羽绒中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌特性研究

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摘要:通过选择性培养基从羽绒中分离得到一株亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌S1,研究了其形态特征、生理生化特征和在不同氧气含量条件下生长的特征。结果表明分离菌株S1在亚硫酸铁琼脂培养基上，37℃厌氧生长过夜后的菌落形态为：菌落圆形边缘整齐，表面干燥粗糙，颜色为黑色；显微观察到菌体两端钝圆，直杆状，无鞭毛，革兰氏阳性菌，产芽孢；在生理生化反应中，分离菌S1的西蒙式枸橼酸盐、MR-VP、甘露醇和葡萄糖反应均为阴性；动力为不扩散生长；硝酸盐培养基为阴性；木糖-明胶4℃呈液态，显色阳性。对氧气的需求为严格厌氧。

关键词：亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌；形态特征；生理生化特征；氧气含量

亚硫酸还原梭状芽孢杆菌是一类能将亚硫酸盐还原为硫化物的梭状芽孢杆菌，而不是一个专门的生物学分类单位，亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的代表性菌株是致黑梭状芽孢杆菌，其他较为常见的还有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌和破伤风梭菌。这类细菌有很强的抵抗力，可以在自然环境中存活很长时间，即使在经适当加工处理后其芽孢仍会存活，条件适宜时又会生长繁殖[1]。其大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，经伤口感染引起疾病。

亚硫酸还原梭状芽孢杆菌是羽毛羽绒检测中主要微生物指标之一，也是引起产品不合格的主要污染菌[2]。而国内关于羽绒亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的特性分析报告很鲜见。本文通过选择性培养基从羽绒中分离出一株厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌，然后研究其菌落特征，菌体显微特征、生理生化特征以及在不同氧气含量下的平板生长特性，以期为羽毛羽绒中准确检测厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌奠定基础，同时为国家标准的修订及规范企业提供实验室依据。

1材料与方法

1.1试剂与材料

菌种来源：亚硫酸还原梭状芽孢杆菌，本实验室分离；大肠杆菌，ATCC11229。

革兰氏染色试剂盒、芽孢染色液、微量生化鉴定管系列、亚硫酸铁琼脂培养基、厌氧液体培养基、庖肉培养基基础等均购自北京陆桥技术有限责任公司。厌氧培养袋， 厌氧产气袋、微需氧产气袋、厌氧指示条均购自日本三菱瓦斯化学株式会社公司。

1.2仪器

RJ-TGL-16G离心机（无锡瑞江分析仪器有限公司）；AL204电子天平（METTLER TOLEDO）；YXQ-LS-75SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；BCN-1360生物洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；GNP-9160隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；2.5L密封培养罐/7.0L密封培养罐（三菱瓦斯化学株式会社）；CX41显微镜（OLYMPUS）。

1.3方法

1.3.1菌种的分离与纯化

亚硫酸还原梭状芽孢杆菌分离参照中国国家标准GB/T 10288―2003《羽绒羽毛检验方法》[3]、FZ/T 80001―2002《水洗羽毛羽绒试验方法》[4] 以及 SN/T 1071―2002《进出口食品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验方法》[5]进行。将羽绒置于无菌0.1%蛋白胨水中，置于75℃的水浴锅中水浴20min以后取出，用亚硫酸铁琼脂培养基对得到的溶液进行严格厌氧的平板培养。将平板于37℃下培养过夜。从亚硫酸铁琼脂培养基上挑取其中典型黑色的圆形菌落，将其接种于具塞的装有250mL厌氧液体培养基的锥形瓶中，在37℃厌氧培养箱中进行液体培养24h，得到一代种子菌液。

1.3.2亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的液体培养

取1mL种子接种到装有250mL厌氧液体培养基的具塞锥形瓶中，在37℃厌氧培养箱中进行液体培养过夜。

1.3.3染色

革兰氏染色、芽孢染色均参照《微生物学实验手册》[6]及《食品卫生微生物学标准鉴定图谱》[7]中进行。

1.3.4显微观察

染色样品在目镜WHB10×、物镜100×/1.25 Oil Ph3下进行观察，拍照。

1.3.5生理生化鉴定

用微量生化鉴定管系列分别对鉴定项目为甘露醇、西蒙式枸橼酸盐、动力-硝酸盐、MR-VP、葡萄糖和木糖-明胶6项进行试验。取培养好的3mL菌液以5000r/min的转速离心 3min，弃上清后加入灭菌的蒸馏水，使其与产品配套的比浊管的浊度一致，然后将菌液加入6个生理生化鉴定管里，厌氧37℃环境下培养24h（木糖-明胶需培养48h），加入指示试剂并观察结果，判断其特性。

1.3.6不同厌氧环境对菌体生长的影响

取培养好的菌液0.2mL接入250mL亚硫酸铁琼脂培养基中，用磁力搅拌器混匀，然后铺到平板上。利用厌氧产气袋和微需氧产气袋将平板均分放置在严格厌氧和微需氧两种不同的厌氧环境下，以及空气中好氧环境中，在 37℃恒温培养，24h后观察菌落生长情况。

2结果与分析

2.1厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的分离和菌落特征

按照1.3.1对亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌进行平板分离。由于这类菌在厌氧条件下生长能产生硫化氢，硫化氢与培养基中的亚硫酸铁反应生成黑色硫化铁，因此在培养基上呈现黑色菌落的就是分离的亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌。随机选择三个大小不同的黑色菌落，分别液体培养后进行镜检，结果显示，所有的菌的形态都一样，因此随机选择了其中的一个菌落，编号S1。如图1所示。

观察可见，菌落正面圆形，侧面为低凸面；边缘整齐；菌落表面干燥粗糙；颜色为黑色，正反面无明显差异；不透明。单个菌落的菌体之间结合紧密，很难分开。

2.2分离菌S1的显微形态特征

2.2.1 革兰氏染色

分离菌S1的革兰氏染色形态图见图2。由图可知，分离菌S1在革兰氏染色后是紫色，是革兰氏阳性菌。菌为两端钝圆，直杆状，无鞭毛，产芽孢。图中透明、边缘紫色、较菌体小的梭状是该菌的芽孢。

2.2.2芽孢染色

分离菌S1的芽孢染色见图3，图中红色的两端钝圆直杆状的为分离菌S1的菌体，绿色的较菌体稍小的梭状的是其芽孢。

2.3分离菌S1的生理生化反应

用微量生化鉴定管系列分别对鉴定项目为甘露醇、西蒙式枸橼酸盐、动力-硝酸盐、MR-VP、葡萄糖和木糖-明胶6项进行试验。液体培养后按照1.3.5方法进行生理生化反应，结果见表1。

由表1可见，分离菌S1的西蒙式枸橼酸盐、MR-VP、甘露醇和葡萄糖反应均为阴性；动力为不扩散生长；硝酸盐培养基为阴性；木糖-明胶4℃呈液态，显色阳性。

2.4不同氧环境对菌生长的影响

分离菌S1分别经严格厌氧、微需氧和空气好氧培养24h后，观察菌落生长情况，如图4所示。

亚硫酸盐还原菌是生态系统中土著微生物类群，是一类形态各异、营养类型多样、能利用硫酸盐或者其他氧化态硫化物来异化有机物质的微生物，在其生长繁殖代谢活动中，除CO2和水外，还产生高浓度的H2S为呼吸终产物。由于培养基中含有亚硫酸铁，该菌生长繁殖过程中将亚硫酸铁还原成为硫化铁，因而形成黑色菌落。菌落越大，由一个菌长成的菌越多，细菌繁殖快，说明细菌适合该条件。

由图4可以明显看出，在空气中，分离菌S1不生长；在含有微量氧气的环境下，菌落可以形成，但是生长不好，形成的菌落小；在无氧、严格厌氧条件下，该菌生长良好，菌落形成数量多而大，是S1最适宜的生长环境。由此可见亚硫酸还原梭状芽孢杆菌是严格厌氧菌，在羽毛羽绒检测过程中要严格控制厌氧条件，以免漏检，造成假阴性。

3结论与建议

分离菌株S1在亚硫酸铁琼脂培养基上，37℃厌氧生长后的菌落形态为：菌落正面圆形，侧面为低凸面；边缘整齐；菌落表面干燥粗糙；颜色为黑色，正反面无明显差异；不透明。单个菌落的菌体之间结合紧密，很难分开。染色后显微观察到菌体两端钝圆，直杆状，无鞭毛，革兰氏阳性菌，产芽孢；观察到菌体两端钝圆，直杆状，无鞭毛，革兰氏阳性菌，产芽孢；在生理生化反应中，分离菌S1的西蒙式枸橼酸盐、MR-VP、甘露醇和葡萄糖反应均为阴性，动力为不扩散生长、硝酸盐培养基为阴性，木糖-明胶4℃呈液态，显色阳性。该菌是严格厌氧菌，在微需氧环境中生长不良，形成菌落很小，因此在羽毛羽绒检测过程中要严格控制厌氧条件，以免漏检，造成假阴性。

通过了解该菌的特性，我们可以控制羽毛羽绒检测中的关键点，提高羽毛羽绒中亚硫酸还原梭状芽孢杆菌等微生物检测能力。

参考文献：

[1]孙慎侠，付昌斌，卢行安，等.盐渍食用菌加工过程中厌氧硫酸盐还原梭状芽孢杆菌污染状况分析[J].现代预防医学.2007,34(16): 3094-3100.

[2]杨闯.羽绒羽毛的还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的检测[J].纺织标准与质量.2007（6）:45-46.

[3]GB/T 10288―2003 羽绒羽毛检验方法[S]．

[4]FZ/T 80001―2002 纺织行业标准――水洗羽毛羽绒检验方法[S]．

[5]SN/T 1071―2002，出入境检验检疫行业标准――进出口食品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验方法[S]．

[6] 周德庆.微生物学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社：1983，14-15.

[7] 刘云国.食品卫生微生物学标准鉴定图谱[M].北京：北京科学出版社：2008，125-132.

(作者单位：谭玉静、李彦、王永林，上海市纤维检验所；刘巧妮、杨阳，华东师范大学生命科学学院)