武井白凤与川中岛白桃组织培养研究
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摘要：选取从日本引进的“武井白凤”和“川中岛白桃”2个桃品种为试验材料，进行了桃茎尖和茎段培养的研究，探讨了取材时期、取材部位、消毒方法、激素配比、大量元素和活性炭对桃组织培养的影响。研究结果表明：“武井白凤”最适诱导培养基为MS＋6-BA1.5mg・L-1＋IAA0.2mg・L-1， “川中岛白桃”最适诱导培养基为MS＋6-BA1.5mg・L-1＋IAA0.1mg・L-1，且取4月、5月的茎段用2%NaClO消毒15min时建立桃外植体最好。桃茎段初代培养时在培养基中加入1%的活性炭对桃组织培养的诱导有益，添加2%的活性炭时则会抑制出芽。将桃茎段外植体接种在MS培养基上时，出芽数和出芽率均高于接种在1/3、2/3MS(大量元素)培养基上。
关键词：武井白凤;川中岛白桃;组织培养
1 引言
桃组织培养技术首先开始于Tukey(1933)进行的桃胚的生长与果实的生长和熟期关系的研究。如今，桃组织培养工作已有较为迅速而广泛的发展，依据培养目的不同而采用了多种外植体，如茎尖、腋芽、叶片、胚、胚乳、胚珠、子叶、悬浮细胞和原生质体等。研究结果以所用品种、外植体类型及生理年龄和培养条件而不同。
桃的器官培养是桃组织培养的一个主要方面。桃的茎尖、茎段培养是建立组织培养程序中的一种简单易行的方法。从整体上组织培养已经成为一门较成熟和完善的技术，但是具体到某种植物，特别是木本果树植物，茎尖、茎段培养技术及工厂化快繁体系还有待于进一步研究和建立。而且组织培养快繁的研究可以提高繁殖系数，在较短的时间提供大量的试管苗，满足生产的需求。因此，探讨桃茎尖、茎段组织培养快繁技术对快速提供优良种苗和接穗具有重要意义。
与草本植物相比，木本植物的离体叶片的组织培养困难得多。由于叶不仅是光合作用器官和水分平衡器官,也是植物的繁殖器官,而且叶片取材方便、来源广泛、操作容易，成为现代生物工程技术研究的主要对象。研究离体叶片的组织培养，是应用生物技术改良品种的一项基础性工作。然而用桃叶片作外植体进行组织培养的研究较少。因此，研究桃离体叶片愈伤组织诱导在理论研究和生产实践中都有重要意义。
2 材料和方法
2.1 外植体材料和试验试剂
本试验选取从日本引进的“武井白凤”和“川中岛白桃”2个桃品种的一年生嫩枝的活动芽以及“武井白凤”一年生枝条的冬季休眠芽作为试验材料。采用由茎段外植体培养所获得的组培苗叶片为诱导叶片愈伤组织的外植体材料。本试验所用试剂有激素6-BA(6-苄氨基嘌呤)，IAA(吲哚乙酸)，IBA(吲哚丁酸)，TDZ(苯基噻二唑基脲)、NAA(萘乙酸)溶液配制均为1.0mg・L-1。
2.2 实验方法
2.2.1 “武井白凤”休眠芽的茎尖培养
分别于2005年10月和2006年1月取“武井白凤”一年生枝条，将其剪成大约20cm，用低浓度的高锰酸钾溶液涮洗2~3min，然后用流水冲洗数分钟，用50mg・L-1GA3处理24h，置组培室水培3~5d，用接种刀和镊子剥去叶芽外层鳞片，留有三角形基部，然后置超净工作台上无菌水清洗2~3次，75%的酒精进行表面消毒15~20s，无菌水清洗3~5次，用0.1%HgCl2消毒12min(在HgCl2中加入1~2滴表面活性剂吐温80)，用无菌水清洗3~5次。取其生长点接种于MS+6-BA2.0mg・L-1的培养基培养。培养15~20d观察其生长表现，并统计污染数，褐变数和死亡数，从而计算出污染率，褐变率和死亡率，计算方法如下：
污染率＝(污染株数/接种的总株数)・100%,
褐变率＝(褐变株数/接种的总株数)・100%,
死亡率＝(死亡株数/接种的总株数)・100%,
然后将生长表现良好的组培苗转接到继代培养基(6-BA0.2~1.0mg・L-1+NAA0.1，0.2mg・L-1)上，待出芽增殖。
2.2.2 “武井白凤”和“川中岛白桃”茎段和顶芽的培养
分别于2005年7月和2006年4月、5月，当日上午8~9时选取“武井白凤”和“川中岛白桃”两个桃品种的一年生幼嫩新枝条作为外植体材料，用塑料保鲜膜保湿带回实验室，用低浓度的高锰酸钾溶液涮洗2~3min，再用自来水冲洗1h左右，剪成1~2cm的茎段和顶芽在超净台上用75%酒精消毒15~20s，无菌水清洗3~5次，用不同的消毒方法消毒(如表1)，在消毒剂中加入1~2滴表面活性剂吐温80，用无菌水清洗3~5次后接种于起始诱导培养基上。起始诱导所用基本培养基为MS，所用生长调节剂(mg・L-1)为6-BA和IAA，其浓度见表2。
表1 不同消毒方法表
编号12345
消毒剂0.1%HgCl20.1%HgCl20.5%NaClO2%NaClO5%NaClO
消毒时间/min812201510
另设置不同的起始诱导培养基(MS、B5和WPM)对“武井白凤”和“川中岛白桃” 茎段进行培养，所用激素为6-BA1.5mg・L-1+NAA0.1mg・L-1，选出其最适诱导培养基。将“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体接种在MS＋6-BA15mg・L-1＋IAA0.15mg・L-1培养基上添加不同浓度的活性炭(0%、0.5%、1.0%和2.0%)培养，观察其出芽数和出芽株数，计算其出芽率。将“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体接种在1/3MS(大量元素)、2/3MS(大量元素)和MS附加6-BA1.5mg・L-1＋IAA0.15mg・L-1培养基上培养，观察其出芽数和出芽株数，并计算其出芽率。
出芽率＝(出芽株数/接种的总株数)・100%
表2 桃茎段初代培养的培养基配方
编号激素123456789
6-BA/(mg・L-1)1.01.01.01.51.51.52.02.02.0
IAA/(mg・L-1)0.10.20.50.10.20.50.10.20.5
2.2.3 培养条件
本试验未经特殊说明，培养基均附加蔗糖30g・L-1，琼脂7g・L-1，pH=5.8，培养基装瓶后在121℃下湿热灭菌20min，培养温度为25±1℃，光照强度为2 000~3 000lx，光照时间为16h/d。
2.2.4 数据处理
对试验所获得的数据，采用方差分析方法，检验在不同处理间外植体的污染率、褐变率、死亡率、出芽率。所用统计分析软件为SAS8.2。
2.3 结果与分析
2.3.1 取材时期对“武井白凤”初代培养的影响
取材时期是组织培养中外植体建立的非常重要的因子，不同的取材时期对外植体的污染率和褐变率是有显著影响的。本研究从2005年7月到2006年5月共取材5次，材料接种于MS+6-BA2.0mg・L-1的培养基上。每个处理接种30个,结果见表4。
表4 不同取材时间对外植体建立的影响
日期
污染率/%
褐变率/%
死亡率/%
2005年7月33.3333.3323.33
2005年10月30.0030.0033.33
2006年1月20.0023.3340.00
2006年4月40.0036.6716.67
2006年5月43.3340.0020.00
由表4可知其中2006年1月取材培养时的污染率最低，其污染率为20.00%，污染率最高是在2006年5月，其污染率高达43.33%；在5次取材中，褐变率最高也出现在2006年5月，为40.00%；而死亡率最高是在2006年1月高达40.00%。由此可见，用休眠芽培养污染较轻，但后期培养中容易出现失活、死亡现象；用活动芽培养污染较重，褐变率也较高，但其在后期培养中死亡率低。方差分析表明，不同取材时间对“武井白凤”组培苗污染率的影响达显著差异水平(F=6.93，p=0.006 1)，对褐变率有显著影响(F=7.75，p=0.004 1)，对死亡率的影响也显著(F=7.85，p=0.003 9)。综合分析取材时间对外植体污染率、褐变率及死亡率的影响，认为4月、5月是最佳取材时间。
2.3.2 不同取材部位对“武井白凤”初代培养的影响
取材部位对外植体建立有显著影响。本研究采用“武井白凤”茎尖、茎段和顶芽3个不同部位接种于MS+6-BA2.0mg・L-1的培养基上培养，每个处理接种30个,结果见表5。
表5 不同取材部位对桃外植体建立的影响
部位
污染率/%
褐变率/%
死亡率/%
茎尖23.3320.0036.67
茎段30.0023.3316.67
顶芽40.0036.6730.00
其结果显示(表5)，用茎尖作为外植体时污染率与褐变率都最低，分别为23.33%和20.00%，但其死亡率最高为36.67%；用茎段作为外植体时其死亡率最低为16.67%；用顶芽作为外植时污染率最高40.00%，褐变率也最高为36.67%，而死亡率居中。方差分析表明，不同取材部位对“武井白凤”组培苗污染率的影响达显著差异水平(F=5.89，p=0.038 5)，对褐变率的影响差异显著(F=6.52，p=0.031 3)，对死亡率的影响也达显著差异水平(F=8.64，p=0.017 1)。综合考虑不同部位外植体的污染率、褐变率和死亡率3因素认为， 4、5月取茎段建立“武井白凤”外植体更容易。
2.3.3 不同消毒方法对桃茎段初代培养的影响
本研究所用材料为“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段，所设置的消毒方法如表1所示，培养基为MS+6-BA2.0mg・L-1。每个处理接种30个。结果见表6。
表6 不同消毒方法对桃外植体建立的影响
品种
消毒方法
污染率/%
褐变率/%
死亡率/%
武井白凤10.1% HgCl2 8min23.3320.0033.33
20.1% HgCl2 12min16.6730.0040.00
30.2%NaClO 20min30.0036.6736.67
42%NaClO 15min20.0023.3326.67
55%NaClO 10min40.0026.6743.33
川中岛白桃10.1% HgCl2 8min26.6723.3340.00
20.1% HgCl2 12min20.0030.0046.67
30.2%NaClO 20min33.3340.0036.67
42%NaClO 15min23.3326.6730.00
55%NaClO 10min43.3333.3340.00
结果表明，用0.1%HgCl2处理12min时(即处理2)对“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体的灭菌效果都较好，污染率都是最低，分别为16.67%和20.00%，但其褐变率较高均为30.00%，死亡率也较高分别为40.00%和46.67%，这可能是由于虽然HgCl2有很强的杀菌能力，但浸泡时间稍长会造成接种材料中毒。用2%NaClO消毒15min效果比较好，其污染率较低分别为20.00%和23.33%，褐变率和死亡率也较低分别为23.33%、26.67%和26.67%、30.00%，所以对于“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体来说是一种较有效的消毒方法。采用0.5%NaClO消毒20min的方法时“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体的褐变率都是最高的分别为36.67%和40.00%，其原因可能是灭菌剂NaClO对接种材料虽然比较安全，但因灭菌时间较长，常常使接种材料的外层氧化变褐，影响培养效果。因此组织培养中，把握好灭菌时间和灭菌剂浓度很重要。方差分析表明，不同消毒方法对“武井白凤”组培苗污染率的影响达显著差异水平(F=5.23，p=0.015 5)，对褐变率有显著影响(F=7.75，p=0004 1)，对死亡率影响差异显著(F=491，p=0018 9)；不同消毒方法对“川中岛白桃”组培苗污染率的影响达显著差异水平(F=522，p=0015 6)，对褐变率的影响差异显著(F=493，p=0018 6)，对死亡率的影响也达显著差异水平(F=441，p=0025 9)。
2.3.4 不同培养基对桃茎段初代培养的影响
本试验用不同的起始诱导培养基对“武井白凤”和“川中岛白桃” 茎段进行培养，所用基本培养基为MS、B5和WPM。所用激素为6-BA1.5mg・L-1+NAA0.1mg・L-1，每个处理接种25个。试验结果如表7。
表7 不同种类培养基对桃茎段初代培养的影响
品种
培养基
出芽数/个
出芽率/%
形态描述
武井白凤MS2784芽分化，健壮，叶片伸展
B51560芽分化，细弱，叶片大而叶色深
WPM2276芽分化，细弱，叶片伸展
川中岛白桃MS1968芽分化，细弱，叶片伸展
B51456少量芽分化，叶片大而叶色深
WPM2680芽分化，健壮，叶片伸展
由表7可以看出，用MS培养基对“武井白凤”茎段的初代培养最好，其出芽数出芽率都较高，而且芽分化，生长健壮，叶片也伸展，虽然用WPM出芽率也较高，但芽生长情况不良。而对于“川中岛白桃”情况则不同，用MS培养出芽数和出芽率都不及用WPM培养高，而且苗生长细弱。用B5培养基培养时，“武井白凤”和“川中岛白桃”的叶片长势非常好，但出芽数和出芽率较低，不是理想的培养基。所以，根据出芽情况以及组培苗和叶片的生长情况可以得出，MS为“武井白凤”的最适培养基，WPM为“川中岛白桃”的最适培养基。方差分析结果表明，不同培养基对“武井白凤”组培苗出芽率的影响达显著差异水平(F=12.44，p=0.007 3)，对“川中岛白桃”组培苗出芽率的影响也达显著差异水平(F=12.00，p=0.008 0)。
2.3.5 激素6-BA和IAA浓度配比对桃茎段初代培养的影响
培养基中激素的种类和浓度是影响植物组织培养的关键因子，也是提高植物离体培养效率的重要因素。一般来讲，只有细胞分裂素与生长素的浓度配比适当，才能诱导植物茎段离体诱导及提高它的诱导效率。本试验以MS为基本培养基，选用了细胞分裂素6-BA和生长素IAA配比组合，分别设置6-BA浓度1.0、1.5、2.0mg・L-1，IAA浓度为01、02、05mg・L-1共9种培养基配方(见表2)，将“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体接种于上述初代培养基上研究这些组合对桃茎段初代培养的影响。结果见表8。
从表8可以看出在不同的6-BA和IAA的激素配比下，“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体出芽数和出芽率最高的均为8号培养基，“武井白凤”和“川中岛白桃”在8号培养基上虽然茎段分化率高，但幼苗的叶片生长细小，且叶色较浅。在3、6和9号培养基上即IAA浓度较高的条件下，茎段基部有大量的愈伤组织发生，这严重影响了茎段芽的分化，茎段小植株生长缓慢，叶片黄化。而在4、5和7号培养基上，茎段分化率较8号偏低，但苗生长健壮，叶片浓绿伸展，无愈伤组织发生。在4号和5号培养基(MS＋6-BA1.5mg・L-1＋IAA0.1~0.2mg・L-1)上“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体长势好，出芽数和出芽率较高；其中5号培养基(MS＋6-BA1.5mg・L-1＋IAA0.2mg・L-1)为“武井白凤” 茎段初代培养的最适培养基；4号培养基(MS＋6-BA1.5mg・L-1＋IAA0.1mg・L-1)为“川中岛白桃”茎段初代培养的最适培养基。这表明不同浓度的激素配比之间，对同一个品种的茎段出芽数和出芽率有不同的影响；相同浓度的激素配比条件下，不同基因型之间的茎段诱导出芽数和出芽率也有所不同。方差分析结果表明，不同浓度的激素配比对“武井白凤”组培苗出芽率的影响达显著差异水平(F=22.77，p＜0.000 1)，对“川中岛白桃”组培苗出芽率的影响也达显著差异水平(F=1925，p＜0000 1)。
表8 6-BA和IAA的激素配比对桃茎段初代培养的影响
品种
编号
出芽数/个
出芽率/%
形态描述
武井白凤11652少量芽分化，叶片大且叶色深
21756少量芽分化，叶片伸展
31548少量芽分化，叶片伸展,基部有愈伤
42172芽分化，健壮，叶片伸展
52380芽分化，健壮，叶片伸展
62264芽分化，叶片伸展,基部有愈伤
72680芽丛生，细弱，叶片伸展
82988芽丛生，细弱，叶片伸展
92268芽丛生，细弱，基部有愈伤
川中岛白桃11552少量芽分化，叶片大且叶色深
21660少量芽分化，叶片伸展
31444少量芽分化，基部有愈伤
42476芽分化，健壮，叶片伸展
52272芽分化，健壮，叶片伸展
62564芽分化，叶片伸展,基部有愈伤
72576芽丛生，叶片细小，叶间距短
82884芽丛生，叶片细小，叶色浅
92368芽丛生，叶片细小，基部有愈伤
2.3.6 活性炭对桃茎段初代培养的影响
活性炭可以吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、酮类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等，从而有利于培养物的生长。陈桂芳等认为在培养基中加入1%左右的活性炭作为吸附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应。本研究将“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体接种在MS＋6-BA15mg・L-1＋IAA015mg・L-1培养基上培养，另添加不同浓度的活性炭，浓度分别为0%、0.5%、10%和20%，观测在不同浓度活性炭的条件下，对“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段初代培养出芽数和出芽率的影响。每个处理接种25个。结果见表9。
表9 不同浓度的活性炭对桃茎段初代培养的影响
品种
活性炭浓度/%
出芽数/个
出芽率/%
武井白凤02376
0.51972
1.02588
2.01660
川中岛白桃02072
0.51976
1.02384
2.01864
由表9可以看出，在培养基中加入1%的活性炭时，“武井白凤”和“川中岛白桃”的出芽数最高分别为25个和23个，它们的出芽率也最高分别为88%和84%；而在培养基中添加2.0%活性炭，“武井白凤”和“川中岛白桃”的出芽数和出芽率明显降低分别为16个、18个和60%、64%。方差分析结果表明，活性炭浓度对“武井白凤”组培苗出芽率的影响达显著差异水平(F=11.11，p=0.003 2)，对“川中岛白桃”组培苗出芽率的影响也达显著差异水平(F=5.78，p=0.021 1)。
因此可以得出，在培养基中加入1%的活性炭时促进“武井白凤”和“川中岛白桃”组培苗出芽；在培养基中添加0.5%活性炭与不添加活性炭，对桃组培苗出芽的影响不大；而在培养基中添加2.0%活性炭则有抑制出芽的现象。所以在培养基中添加适当浓度的活性炭对于“武井白凤”和“川中岛白桃”的初代培养是有利的，当所添加活性炭的浓度过高时会影响其出芽，这可能是因为活性炭在吸附有害物质时也吸附培养基中的有益物质，从而影响了分化和生长。
2.3.7 大量元素对桃茎段初代培养的影响
本研究将“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体接种在1/3MS(大量元素)、2/3MS(大量元素)和MS附加6-BA1.5mg・L-1＋IAA0.15mg・L-1的培养基上，每个处理接种25个。培养15d，观测含不同大量元素的MS培养基对“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体出芽数和出芽率的影响。结果如表10所示。
表10 大量元素对桃茎段初代培养的影响
品种
基本培养基
出芽数/个
出芽率/%
武井白凤MS2384
2/3MS1964
1/3MS1348
川中岛白桃MS1872
2/3MS1660
1/3MS1244
从表10可知，当“武井白凤”和“川中岛白桃”茎段外植体接种在MS培养基上时，出芽数和出芽率分别为23、18和84%、82%，均高于接种在1/3和2/3MS(大量元素)培养基上，且在MS培养基上“武井白凤”茎段外植体的出芽数和出芽率又高于“川中岛白桃”。随着MS培养基中大量元素含量的逐渐减少，桃茎段外植体出芽数和出芽率也逐渐降低，而且在3种培养基中 “武井白凤”茎段外植体的出芽数和出芽率都高于“川中岛白桃”。由此可见，只有保持培养基中大量元素的含量，才能维持桃茎段外植体正常生长的条件并提供所需的营养成分。方差分析表明，大量元素对“武井白凤”组培苗出芽数的影响差异显著(F=27.11，p=0.001 0)，对“川中岛白桃”组培苗出芽率的影响差异显著(F=1644，p=0003 7)。
3 结语
(1)外植体的建立。影响外植体建立的因素很多，有外植体本身的遗传性状、生理状态、极性、发育阶段、取材时间、取材部位，以及取材大小等。本研究通过对污染率、褐变率和死亡率的综合分析探讨了取材时间、取材部位和消毒方法对外植体建立的影响。取材时间应该选在春季4月、5月，这时芽体萌动生长旺盛，接种后污染率低、成活率高。选用休眠芽进行培养虽然污染率低，但是其在培养数天后开始发黄枯萎，死亡率很高。用顶芽做外植体时褐变率最高，这可能是因为不同的生理部位酚类物质和多酚氧化酶的含量不同。综合分析，用活动芽的茎段作为试验材料时对外植体建立最佳。在消毒剂的选取上，本研究选用了NaClO和HgCl2作对比。现在一般使用HgCl2作为消毒剂，但是HgCl2浓度和处理时间不容易控制，而且HgCl2是重金属，所以HgCl2并非最佳选择。本试验用2%NaClO(消毒液中加1~2滴吐温80)对外植体消毒15min也可达到良好的效果。但是对于不同的品种，消毒剂的浓度与处理时间是不同的，NaClO的具体用法还有待于进一步研究。
(2)植物生长调节剂对桃组织培养的影响。植物生长调节物质是植物离体培养中的关键物质，对植物离体培养起着决定性的作用，而且不同植物对植物生长调节物质种类、浓度要求不一致；不同培养阶段，植物生长调节物质的种类和浓度也不完全相同。本试验得出高浓度的6-BA和低浓度的IAA配比有利于起始诱导芽分化。继代与增殖是离体培养的优势阶段，若要得到理想的繁殖系数，生长调节剂在试管苗增殖中起重要作用。本试验结果表明，6-BA浓度降低有利于提高增殖倍数，这可能在起始诱导芽分化时需要高浓度的细胞分裂素打破顶端优势，而继代培养时内源激素的持续积累导致内源激素浓度升高，所以在继代培养时需降低细胞分裂素的浓度。
(3)活性炭对桃初代培养的影响。在培养基中加入活性炭主要是为了吸附植物的有害分泌物，但活性炭对物质吸附的选择性很低，它同时也能吸附某些植物必需的化合物。因此有关活性炭在组织培养中作用的报道常常有矛盾，有的称培养基中加入活性炭有利于培养物的生长和分化，有的则称活性炭能抑制培养物生长。本试验结果表明在培养基中添加适当浓度的活性炭对于“武井白凤”和“川中岛白桃”的初代培养是有利的，当所添加活性炭的浓度过高时会抑制其出芽，这可能是因为活性炭在吸附有害物质时也吸附培养基中的有利物质，从而抑制了分化和生长。
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Research On Tissue Culture of Peach Cultivars
――A case study of “Wujingbaifeng” Peach and “Chuanzhongbai” Peach
Zhang Qiumei
（Forestry bwreau of Zezhou,Shanxi Jingcheng 048000,China）
Abstract: Taking two peach cultivars“Wujingbaifeng” and “Chuanzhongbai” imported from Japan as experimental materials,this paper makes research on culture of peach shoot tips and stems,and discusses the influence ofselecting periods,selecting parts,sterilizing ways,hormone combination,macro-element and activated carbon on peach tissue culture. The results are as follows:(1)The optimum medium of “Wujingbaifeng”peach shoot propagation during the primary culture is MS＋BA1.5mg・L-1+IAA0.2mg・L-1 and that of “Chuanzhongdao” is MS＋BA1.5mg・L-1+IAA0.1mg・L-1,and the best peach explants are proved to be the stems selected in April or May and sterilized by NaClO(2%)for fifteen minutes. (2)It is beneficial for the induction of stems to add 1% activated carbon to the culture medium during the primary culture,whereas adding 2% activated carbon can inhibit the budding growth.(3)The budding number and rate of MS medium are higher than that of 1/2 and 2/3 MS medium.
Key words: “Wujingbaifeng” peach；“Chuanzhongbai” peach;tissue culture