侧耳属种间杂交选育白色高产菌株
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摘要：以白黄侧耳（Pleurotus cornucopiae）菌株姬菇258和糙皮侧耳（P.ostreatus）菌株青平1号为亲本，单孢杂交，选育出两株白色优质高产姬菇新菌株28号和41号菌株。28号和41号菌株的出菇单产较生产上主栽菌株西德33（对照）增产19.2%和19.1%；28号和41号菌株商品菇比例（88.6%和85.6%）高于对照西德33（71.8%），即菇体商品性优于对照；综合体现出了亲本菌株姬菇258的优质丰产性和亲本青平1号的白色菌盖菇体特征。拮抗试验和ISSR标记试验表明，28号和41号菌株与亲本具有遗传差异，即为不同于亲本的新菌株。研究认为，28号和41号菌株具有“姬菇”的典型商品性特征，是2株优质高产的白色姬菇新菌株，可做进一步的中间试验和示范栽培。
关键词：种间杂交；单孢杂交；出菇单产；商品菇比例；拮抗试验；ISSR标记
以白黄侧耳（Pfeurotus cornucopiae）为代表，子实体的菌盖较小（0.5 cm≤菌盖直径≤3.5 cm）、菌柄较长、较细的侧耳属统称姬菇，又称小平菇。姬菇质地细嫩、味道鲜美、营养丰富_2]。四川省是全国姬菇生产的主要省，姬菇产量占全国产量的29.62%_3]。20余年来四川省生产上一直使用的栽培菌株主要为西德33和闽31等，而这些主栽菌株均存在着不同程度的种性退化、单产大幅度下滑等问题。随着姬菇产业的快速发展，生产上迫切需求新品种替代现有品种，促进姬菇产业持续发展。
国内姬菇品种选育相关报道较少。阮瑞国等采用组织分离法获得的新菌株“宁姬018”。池惠荣等以台湾小白平和科佳1号为亲本，杂交选育白色新菌株“科杂一号”。笔者以西德33与姬菇53杂交获得新菌株432（四川省品种审定为“川姬菇2号”）；以西德33与姬菇51杂交获得新菌株258（四川省品种审定为“姬菇258”）。杂交选育出的姬菇新品种，具有出菇整齐、产量高、品质好的特点。笔者以姬菇258（白黄侧耳，P.cornucopiae）和青平1号（糙皮侧耳，P.ostreatus）为亲本，通过单孢杂交，拟选育白色优质的姬菇新菌株。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
试验所用白黄侧耳（P.cornucopiae）菌株姬菇258和西德33（西南地区主栽菌株）以及糙皮侧耳（P.ostreatus）菌株青平1号均保存于四川省农业科学院土壤肥料研究所微生物研究室。
1.2 培养基质
PDA培养基：200 g马铃薯、20 g葡萄糖、22 g琼脂，1000 mL水。
栽培料：44%稻草粉、26%棉籽壳、22%高粱壳、4%玉米粉、4%石灰，含水量为65%。
1.3 试剂
供试11个引物（表1，从75个UBC.ISSR通用引物中筛选出）与真菌基因组DNA抽提试剂盒由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其它试剂购自成都市长征化学试剂公司。
1.4 构建杂交菌株
以平板稀释方法，在PDA培养基上分别分离获得姬菇258和青平1号两个菌株的单孢菌丝，杂交获得双核菌丝新菌株。
1.5 新菌株栽培性状
1.5.1 初筛试验
20 cm×42 cm×0.025 cm聚乙烯塑料袋装料（干料）1.14 kg。对杂交菌株进行袋料栽培出菇初筛试验，每个菌株接种10袋，设3个重复，即每个处理共30袋，选择高产并具有“姬菇”典型性状的菌株进入复筛试验。
1.5.2 复筛试验
采取随机区组试验设计，对供试菌株姬菇258、西德33和初筛的杂交新菌株进行栽培出菇比较试验。每个菌株接种30袋，设3个重复，即每个处理共90袋。发菌和出菇塑料大棚的棚内管理环境、菇体采摘标准和采菇时间（每天上午采收，截至第3潮菇结束）菌株各处理均保持一致。分别观察记录供试菌株发菌期的菌丝生长势及生长速度、出菇期的原基形成、菇体色泽、菇体分级E123比例和子实体产量等性状指标；利用SPSS数据分析软件分析菌株间出菇单产的差异显著性。
1.6 新菌株真实性鉴定
1.6.1 拮抗试验
在PDA固体平板培养基上，在距平板圆心1 cm处对称接种2个不同菌株菌种块（直径0.5 cm），作对峙培养，设同一菌株对峙培养作对照，3个重复。25℃培养14 d，观察比较菌株间的拮抗现象及其强弱程度。
1.6.2 ISSR标记分析
供试菌株DNA提取参照试剂盒说明书进行。PCR反应体系（30μL）：2×PCR MasterMix 15 gL，Primer 2 gL，ddH2 O 12μL，模板DNA 1μL；PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火45 s（退火温度视引物而定），72℃延伸1.5 min，共35个循环；最后72℃延伸7 min；4℃保存。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离，Goldview染色，Bio-Rad凝胶成像系统照相。
2 结果与分析
2.1 杂交菌株及初筛结果
分离获得青平1号和姬菇258单孢菌株各22株，共设计484个杂交组合，镜检筛选获得具有锁状联合并能出菇的杂交新菌株46株。46株菌株初筛试验结果表明，3号、20号、28号、41号、63号和111号这6株菌株具有菌盖较小，菌柄较长、较多、较细E113的“姬菇”典型商品性特征。
2.2 复筛试验结果
2.2.1 发菌情况
6株杂交菌株、对照西德33及亲本菌株姬菇258均为接种后2 d开始萌发。菌丝生长速度范围在0.6～0.9 cm/d之间，其中，姬菇258的菌丝生长最慢，20号和西德33的菌丝生长速度最快（表2）。除了3号菌株菌丝生长势一般之外，其余菌株均表现出较强生长势。
2.2.2 出菇情况
原基形成天数（从接种到出现子实体原基）在29～46 d之间。供试菌株出菇平均袋单产在689～1161 g之间，其中，单产最低的菌株为111号，单产最高的菌株为菌株41号、3号和28号，单产均高于两个对照（西德33、姬菇258），较生产上主栽姬菇菌株西德33分别增产19.1%、19.2%和19.2%，增产效果的差异性达到极显著水平，但是与姬菇258差异不显著（表2）。
研究考察比较了供试菌株单丛菇的菇重、分级比例、整齐度和菌盖颜色等商品性指标。结果表明，供试菌株单丛菇平均菇重在121.5～313.1 g之间。
供试菌株商品菇比例在69.3%～98.0%之间，菌株商品菇比例由小到大依次为3号、西德33、111号、20号、41号、28号、姬菇258和63号。供试菌株菇丛的整齐度：63号菌株和姬菇258表现为整齐，20号、41号和28号菌株表现为较整齐。供试菌株菌盖颜色：杂交菌株3号、20号、41号和28号的菌盖表现为白色（表2、封二图1）。
2.3 菌株鉴定
2.3.1 拮抗试验结果
供试菌株之间对峙培养结果表明，杂交菌株（3号、20号、41号、63号、111号、28号）之间、杂交菌株与亲本（姬菇258、青平1号）之间均产生了明显的拮抗线，拮抗线宽厚并转色（表3），初步表明供试菌株为不同的菌株。
2.3.2 ISSR的多态性
11个引物将供试6个杂交菌株及两个亲本菌株共扩增出70条清晰易辨的DNA条带，其中多态性条带为63条，比例为90%，DNA带的大小为200～2000 bp。其中，引物31扩增供试菌株DNA的指纹图谱见图2，菌株41号、63号、111号和28号具有不同于亲本姬菇258和青平1号的特有条带，说明这4个菌株是不同于亲本的新菌株。
3 讨论
本试验筛出了41号、28号和3号三株具有“姬菇”典型特征的白色高产新菌株，其出菇单产虽然与亲本姬菇258差异不显著，但是较生产上主栽菌株（西德33）增产效果极显著。且28号和41号菌株的菇体商品菇比例高于对照西德33，菌盖颜色均为白色，菇丛整齐度表现也较好。因此，综合单产和商品性等主要指标认为，菌株28和菌株41是具有优质高产特点的白色姬菇新菌株（目前四川还没有白色姬菇新菌株的报道；全国仅有池惠荣等报道过1株白色姬菇），可以进一步做中间试验和示范栽培。
63号菌株的产量虽然低于对照西德33，并且差异极显著，但是其菇体商品菇比例远高于对照西德33。该菌株在11月末期开始出菇，12月产量出现高峰，在3月初也还有一定产量分布，可能是一个在生育期和出菇温度类型上有别于亲本的新菌株，有待进一步研究分析。菌株3号、20号在11月子实体产量出现高峰值；菌株111号、28号、63号和41号在12月出菇产量出现高峰值，28号、41号、姬菇258在3月只有很少的产量分布。
本试验以灰色菌盖的姬菇258品种与白色菌盖的平菇青平1号菌株杂交，获得了具有“姬菇”典型商品性特征（分化的菌柄较长、较多、较细）、优质高产白色的优良新菌株（28号和41号菌株），说明，通过杂交途径，将亲本姬菇258品种的优质高产特性与亲本青平1号的白色菇体特征进行了有机融合，创制出了既具有优质高产特性、又具有菌盖白色特征的杂交新菌株28号和41号菌株，有望为四川省甚至西南地区食用菌产区增添新的姬菇杂交品种。
本试验获得杂交菌株的成功率和获得杂交姬菇菌株的成功率均比较低，分别为9.50%和1.24%。其具体原因还需进一步分析研究。