AMPK活化对骨骼肌中MAFbx mRNA\MuRF1 mRNA的表达和3-MH含量的影响

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摘要：通过给sD大鼠注射ampk激动剂AICAR，提高大鼠骨骼肌中AMPK的活性，探讨AMPK活性变化对骨骼肌蛋白质降解的作用。采用同位素技术测定腓肠肌中AMPK活性的变化；采用实时荧光定量PCR技术，测定腓肠肌中MuRFl、MAFbx基因表达量的变化。结果显示AICAR注射后l、2、7 h，AMPK活性与对照组相比升高，差异有显著性或非常显著性意义(P

关键词：运动生物化学；腺苷酸活化蛋白激酶；泛素蛋白连接酶；3-甲基组氨酸；蛋白质降解：大鼠

中图分类号：G804.7　文献标识码：A 文章编号：1006-7116(2010)08-0112-06

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)在真核细胞生物中广泛存在，属丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。2005年Thomson研究报道AMPK可能抑制骨骼肌蛋白质的合成，其采用老年大鼠和成年大鼠为实验对象，进行机械刺激促使大鼠肌肉肥大，观察到随着年龄增大大鼠快肌肥大情况随之下降，快肌中AMPK活性反而增加；大鼠慢肌纤维随着年龄增大肥大情况没有差异，慢肌中AMPK的活性也没有差异。研究者认为年龄造成的AMPK活性的升高可能是造成快肌肥大程度减弱的原因。

泛素蛋白酶体系统是一个主要的蛋白质降解系统，对动物的研究逐渐显示：在肌肉萎缩过程中，泛素蛋白酶体系统促使蛋白质降解。Muscle Ring FingerI(MuRFl)和Atrophy F-box(mafbx也称为Atrogin-1)均属于泛素蛋白连接酶，是目前发现的与骨骼肌蛋白质分解代谢关系最为密切的泛素蛋白连接酶。有证据表明MuRFl和MAFbx仅在骨骼肌中表达，在肌肉处于分解代谢过程中MuRF1和MAFbx表达增加。目前研究认为MuRF1和MAFbx是骨骼肌蛋白质降解的标志。测定其表达量的变化可反映骨骼肌蛋白质的降解情况。

3-甲基组氨酸(3-methylhistidine，3-MH)是一种微量氨基酸，主要存在于骨骼肌的肌动蛋白和肌凝蛋白内(约91.1％)，是组氨酸在形成组氨酰-tRNA后发生甲基化的产物，且蛋白质分解代谢释放的3-MH，不能作为tRNA的底物被重复利用合成肽链，而从尿液中定量排出。因此，测定3-MH的释放量可间接反映肌纤维蛋白的降解率，是追踪骨骼肌蛋白质分解代谢状况的良好指标。3-MH排出增多主要见于外伤、感染等应激情况。有报道在烧伤病人骨骼肌中，观察到3-MH含量升高。2008年检测悬吊引起的肌肉萎缩中，发现悬吊后肌组织间隙渗透的3-MH含量增多44％。

有报道运动过程中，AMPK活性显著升高，能抑制蛋白质的合成。而关于AMPK活性升高促进骨骼肌蛋白质的降解研究较少，2007年有报道用5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5 -aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside，AICAR)处理C2C12肌管，观察到基质中3-MH的含量升高和MAFbx mrna、murf1 mrna的表达，认为AMPK活化刺激了C2C12肌管中肌纤维蛋白的降解。目前，还没有见到在大鼠活体组织上注射AICAR，以探讨AMPK活性变化对骨骼肌蛋白质降解的研究。本研究拟采用大鼠一次性注射AMPK激活剂AICAR，提高骨骼肌中AMPK活性，观察大鼠腓肠肌中MuRFl、MAFbx基因表达量和3-mh含量的变化，探讨AMPK活性升高对骨骼肌蛋白质降解的作用，以及探讨MuRF1、MAFbx基因表达量和3-MH含量在反映骨骼肌蛋白质降解中的差异。

1　材料与方法

1.1　实验动物

8周龄健康雄性SD大鼠(SPF级，许可证号：SCXK(京)2007-0001，动物编号：0068277)，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体重180-200 g，屏障环境饲养，温度(23±2)℃，相对湿度(65±5)％，昼夜明暗交替时间为12 h／12 h。每笼4只，自由饮食与饮水(饲料购于北京维通利华实验动物技术有限公司)。

1.2　注射方案

大鼠安静饲养3 d，以适应新环境。24只大鼠分为4组，每组6只。根据大鼠用药后的取材时间分：AICAR注射后1 h组(AI)、AICAR注射后2 h组(A2)、AICAR注射后7 h组(A3)、生理盐水对照组(C2)。C2、A1、A2、A3组大鼠的体重分别为(200.4±8.01、(200，0±11.0)、(200.0±9.0)、(198.3±9.0)g。注射组以0.5mg/g剂量在大鼠后肢大腿外侧皮下一次性注射AICAR溶液(质量浓度为75 mg／mL，在37℃水浴中溶解)，生理盐水注射部位、剂量同AICAR。

1.3　样品制备

大鼠分别于AICAR注射后1、2、7 h时间点称重，用质量分数2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，注射剂量为0.002 5 mL／g。腹主动脉取血后，迅速分离大鼠右后肢肌肉，取等量的红、白腓肠肌，用锡纸包好，投入液氮中保存。取材完成后把标本转移至-80℃冰箱保存待用。

1.4　3-甲基组氨酸测定 高效液相色谱(high performance liquid chromatog-raphy，HPLC)检测骨骼肌3一甲基组氨酸(3-MH)含量。

1)肌肉组织的处理。

称取50mg左右的腓肠肌组织，加入到有500μL预冷高氯酸溶液(质量分数为3.0％)的1.5 mL离心管内，用眼科剪迅速剪碎，冰浴中高速匀浆(32 000r／min)10 s，14000g，4℃离心25min，沉淀蛋白，提取上清液。注意肌肉匀浆一定要充分。

2)柱前衍生。

取50μL上清液至1.5 mL离心管内，加入125μL 0.2 mmol／L硼酸钠(先配制0.2 mmol／L硼酸，用氢

氧化钠将pH值调至12.2)，旋涡振荡，缓慢加入125μL乙睛(含荧光胺1.6g/L)混匀，静置5min后，加入质量分数为70％高氯酸18μL，盖紧离心管，80℃水浴1h。冷却至室温后，加入中和剂3 mol／L的NaOH(MOPS浓度0.5 mol／L)50μL，使标本液终pH在6.0左右，即上机分离、检测。

3)色谱条件。

流动相采用10 mmol／L磷酸钠缓冲液，缓冲液中含有乙腈(缓冲液中乙腈的体积分数为30％，pH 7.5)，等速洗脱，流速1.0 mL／min，进样量100μL，经ZorbarxSB-C18柱(4.6 min×150 mm，5μm，柱温常温)分离，荧光分光光度计检测波长。激发365 nm／发射460 nm发射。外标法定量。注意乙腈要选用光谱纯，降低本底值。

4)色谱分离。

3-MH的出峰时间约是5.2 min。

5)标准曲线和最低检测浓度。

配制3-MH标准液的浓度分别为2.5、5.0、7.5、10.0、15.0μmol／mL，按样品处理方法进行测定。利用3-MH标准品的不同浓度(μmol／mL)与各自对应的积分面积(S)建立回归方程，通过回归方程计算出各个样品中3-MH的量。

1.5　AMPK活性的测定方法

1)AMPK的提取。

将-70℃冻存的骨骼肌在液氮中研磨粉碎、匀浆；称取100 mg匀浆样品，加入预冷样品匀浆液1.2 mL，超声波间断破碎3次，每次3 s，间隔6 s(破碎过程中样品冰浴)；破碎后，立即将样品转移人预冷离心管中，于4℃、48 000g条件下离心30 min；收集上清液，每mL上清液中加入质量分数为280μg(NH4)2SO4，冰浴上振荡30 min；4℃、48 000g条件下离心30 min；弃上清液，向沉淀中加入预冷样品缓冲液(初始体积的1／10)，溶解沉淀；于4℃、48000g条件下离心30min，收集上清液置于-70℃保存备用。

2)AMPK活性的测定。

根据 AMPK 使特异性肽底物SAMS(HMRSAMSGLHLVKRR)磷酸化的原理，以[y―32P]ATP作为磷供体检测酶的活性。

EP管中加入AMPK反应缓冲液10μL、底物SAMS肽液10μL(2μM／Ix L)和[y-32P]ATP混合液10 μL(0.5μci/μL)，30℃水浴5 min。取出，加入AMPK样品酶液10μL，30℃水浴15 min。反应结束后，吸取30μL反应液吸附于Whatman P81滤纸(1cm2)上，待滤纸干燥后，放入500 mL质量分数为1％磷酸中漂洗3次，每次5 min。最后将滤纸放入加有200 mL丙酮的培养皿中漂洗5 min。

自然干燥后，放人已编号的闪烁瓶中，加入5 mL闪烁液，立即用PACKARD TRI-CARB 2000CA型液闪计数仪计数。同时做两种对照，即不加酶源对照(AMPK样品酶液替换为样品缓冲液)和不加[y-32P]ATP对照([y-32P]ATP混合液替换为不含[y-32P]ATP的ATP液)，操作同上。

AMPK活力单位：300C条件下，每分钟将1 nmol磷催化转入SAMS的酶量即1个单位酶活。AMPK活性计算方法是：样品CPM减去空白对照CPM的差除以1 nmol磷的CPM的商，再除以样品酶液的蛋白含量与反应时间的积，再除以测定反应液体积与反应液总体积的比值。

1.6　用实时荧光定量聚合酶链式反应技术测定腓肠肌MAFbx和MuRF1基因的表达

1)RNA的提取方法。

用Tfizol总RNA提取试剂盒提取腓肠肌中的总RNA。在提取过程中，加入了DNA酶，专门去除总RNA中DNA的杂质，保证RNA的纯度。提取结束后，取1μL提取的总RNA，用核酸浓度测定仪(德国)，分别测定波长为260和280 nm的吸光度值，计算A260/A280的值，以鉴定所提取的RNA的纯度，各个样A260/A280值都在1.9以上左右，可认为所提取的RNA较纯，可进行下一步实验。

2)反转录。

采用TOYOBO公司提供的反转录试剂盒。在0.2mL离心管中加入5×RTbuffer 4μL、10mmol／L dNTPMixture 2μL、RNase inhibitor 1μL、Oligo(dT)lμL、Reverse Tra Ace 1μL、1μg RNA(0.7～1.4μL)，加水至20μL。涡旋混匀，稍微离心，42℃孵育30min，85℃变性5min，4℃培育5rain，然后逆转录产物，-20℃保存待用。

3)实时荧光定量聚合酶链式反应。

实时荧光定量聚合酶链式反应的条件：在0.2 mL离心管中加入cDNA 0.5μL，上下游引物各0.5μL，水8.5μL，94℃预热变性4min，94℃变性20 s，62℃退火20 s，72℃延伸10 s，扩增40个循环，末次循环72℃延伸5 min，4℃保存5 min。MAFbx 75 bp(GeneBank accession AY059628，5’TCC TGG ATT CCAGAAGATTCAAC 3’，5’TCAGGGATGTGAGCTGTGACT T 3’)；MuRFl 167 bp(GeneBank accession Ay059627，5’ACAACCTCTGCCGGAAGTGT 3’，5’CCG CGG TTG GTC CAG TAG 3’)；GAPDH 177bp(GeneBank accession BC059110，5'gga tgc agg gat gatgtt c 3’，5'tgc acc ace aactgctta 3)。

1.7　统计学处理

数据以均数±标准差表示，采用SPSS统计软件包进行单因素方差分析。以P

2　结果及分析

2.1　AICAR一次性注射后各组AMPK活性变化

AICAR注射后，C2、A1、A2、A3组中AMPK的活性分别是(0.34±0.16)、(0.89±0.14)、(0.98±0.21)、(0.58±0.22)nmol／(g・min)。AMPK活性与生理盐水对照组相比升高，A1、A3组与对照组比较差异有显著性(P

2.2　AICAR一次性注射后各组MuRFl mRNA、MAFbx

mRNA表达量变化

与生理盐水对照组相比，AICAR注射后1、2 h，MAFbx mRNA表达量升高(2.45±0.80)、(2.23±0.59)倍，差异有非常显著性意义(P

与生理盐水对照组比较，AICAR注射后1、2 h，MuRF1 mRNA表达量分别升高(2.67±0.64)、(2.30±0.30)倍，差异有非常显著性意义(P

2.3 AI OAR一次性注射后各组3-MH质量摩尔浓度的变化

与生理盐水对照组比较，注射AICAR后，各组3-MH的表达量有下降趋势，c2、A1、A2、A3组中3-MH的质量摩尔浓度分别是：(0.53±0.12)、(0.40±0.20)、(0.32±0.18)、(0.42±0.21)μmol／mg。但是差异没有显著性意义(P>0.05)。

3　讨论

AICAR是目前应用较多的AMPK激活剂，它是腺苷的类似物，进入细胞后在腺苷激酶的作用下转化为单磷酸核苷(5-aminoimidazole-4-carboxamide-l-D-ribofuranosyl-5-monophosphate，ZMPl，ZMP是AMP的类似物，它能够变构激活AMPK和其上游激酶AMPKK(AMPK kinases)，后者继而激活AMPK。

AICAR是AMPK的有效激活剂，这已经被大量实验所证实。本研究观察到大鼠注射AICAR后1、2、7 h，AMPK活性显著升高，在注药后7 h，AMPK活性开始下降，说明注射AICAR后，促进了AMPK活性的升高，证明建立的实验动物模型成功，满足本实验要求。

MuRF1和MAFbx均属于泛素蛋白连接酶，主要在骨骼肌中表达，是目前发现的与骨骼肌蛋白质分解代谢关系最为密切的泛素蛋白连接酶，它们表达量的升高可反映骨骼肌蛋白质的降解。有报道称在制动、去神经、后肢悬吊、饥饿以及病理(糖尿病、肿瘤、脓毒症)等情况下诱导骨骼肌萎缩的模型中，MuRF1、MAFbx表达量均明显增高。另有报道MuRF1与MAFbx基因缺失的小鼠，表现型均是正常，但2种小鼠在去神经诱导的骨骼肌萎缩时，骨骼肌萎缩程度较轻，这些发现证明抑制MuRF1与MAFbx基因的表达，可减轻诱导肌肉萎缩因素引起的肌肉萎缩。

本研究显示，AICAR注射后1、2 h，MAFbxmRNA、MuRF1 mRNA表达量升高，差异有非常显著性意义(P

3-甲基组氨酸(3-MH)只存在于肌纤维蛋白中，肌纤维蛋白质被降解后，释放的3-甲基组氨酸不再参与新蛋白质的合成，故其释放量可间接反映肌纤维蛋白的降解。在外伤、感染、烧伤等应激情况下，3-MH排出增多，故在医学界常用测定尿、血和骨骼肌组织中3-MH的含量，以检测骨骼肌蛋白质的降解情况。有报道称在烧伤病人骨骼肌中3-MH含量显著升高。

本研究观察到大鼠注射AICAR后，骨骼肌中3-MH没有升高，且有下降趋势，但差异没有显著性意义。这与Nakashima报道不完全一致，其用AICAR处理C2C12肌管，观察到基质中3-MH均升高，研究者认为AMPK活化刺激了C2C12肌管中肌纤维蛋白质的降解。本研究用AICAR直接注射到大鼠大腿外侧肌肉，观察到AICAR注射后大鼠腓肠肌中3-MH没有变化。我们认为：AICAR注射后，3-MH没有升高可能有两种原因：(1)目前3-MH测定方法的敏感度可能不高，在骨骼肌蛋白质降解较弱时，3-MH的变化不能被检测到。2009年Hansen等报道，受试者进行210次高速最大离心收缩运动，一条腿自愿运动，另一条腿采用电刺激被动运动，观察到自愿运动腿骨骼肌间隙中3-MH量在运动后即刻没有明显变化，但是电刺激腿运动后即刻骨骼肌间隙中3-MH量比自愿运动腿显著升高。认为电刺激的刺激部位仅限制于骨骼肌的局部，对局部骨骼肌的刺激作用较强，而自愿运动机体对骨骼肌的作用是交替的、多样的，可能对骨骼肌的刺激作用较弱，所以没有观察到骨骼肌内3-MH量的变化。2008年，Vary等在研究酒精中毒对骨骼肌蛋白质降解的影响时，观察到MAFbx mRNA和MuRFImRNA基因表达量增加，却没有观察到3-MH量的变化，同样有关运动后6 h内，骨骼肌蛋白质降解的一些报道，也没有观察到骨骼肌内3-MH量的变化。说明骨骼肌蛋白质降解较强时，才可能观察到骨骼肌中3-MH量的增加。本研究在体一次性注射AICAR提高AMPK活性与骨骼肌出现脓毒症和烧伤的病理情况相比，其促进骨骼肌蛋白质降解的作用可能要弱些，所以检测不到3-MH的变化。(2)在体组织的血液循环可能是影响骨骼肌中3-MH测定的另一个重要原因。Nakashima研究结果观察到C2C12肌管中3-MH量升高，可能是由于其研究的材料是C2C12肌管，不存在血液循环作用，故随着时间延长，肌管中3-MH的堆积可能较多，便于检测。本研究的材料是骨骼肌活体，骨骼肌产生的3-MH可能被血液循环清除，使骨骼肌中积累的3-MH较少，所以本研究没有检测到骨骼肌中3-MH量的变化，但血中或尿中3-MH的量可能会升高。本研究没有检测大鼠血中或尿中的3-MH量，所以还不能确定A1CAR注药后，骨骼肌中3-MH量的变化，因此对一次AICAR注射后在体骨骼肌中3-MH量的变化还需要进一步的研究。

本研究观察到MAFbx mRNA、MuRFl mRNA表达量在AICAR注射后显著升高，而3-MH量却没有变化，结合VarytSl的研究检测到MAFbxmRNA、MuRFl mRNA表达量升高，3-MH量没有变化，作者认为在反映骨骼肌蛋白质降解方面，MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表达量与3-MH量变化不一致，或者说明在反映骨骼肌蛋白质降解方面MuRFl mRNA、MAFbx mRNA比3-MH可能更敏感。测定骨骼肌中3-MH的量反映骨骼肌蛋白质降解的方法还需要进一步完善，提高其测定的敏感度和减少血液循环对其测定结果的影响。

总之，本研究认为大鼠一次性注射AICAR后，能显著提高其腓肠肌中AMPK的活性，AMPK活性的升高又能促进MAFbx mRNA和MuRF1 mRNA的表达，促进骨骼肌蛋白质的降解。