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人脑胶质瘤干细胞增殖中NOTCH信号的调控作用

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【摘要】 目的:探讨人脑胶质瘤干细胞增殖notch号的调控作用。方法:采用免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞株中提取、分离人脑胶质瘤干细胞,对细胞进行体外培养,采用荧光定量PCR、免疫组化等方法检测相关指标,观察人脑胶质瘤干细胞增殖中NOTCH信号通路的调控作用。结果:正常脑组织的NOTCH-1蛋白累积光密度值为(294.9±29.5),低度及高度恶性胶质瘤患者的NOTCH-1蛋白累积光密度值分别为(5046.0±120.9)和(11 026.2±169.1)。低度及高度恶性胶质瘤患者的NOTCH-1蛋白表达水平较正常脑组织患者明显提高,且高度恶性胶质瘤患者的NOTCH-1蛋白表达水平较低度恶性胶质瘤患者明显提高,比较差异均有统计学意义(P

【关键词】 人脑胶质瘤干细胞; 增殖; NOTCH信号; 调控作用

【Abstract】 Objective:To study the NOTCH signal regulating role in human brain glioma stem cell proliferation.Method:Using magnetic beads immune method extracted from the organization for human brain glioma and glioma cell line,separated the brain glioma stem cells,cells for in vitro culture,used the fluorescent quantitative PCR and immunohistochemical method to detect the related indicators,observed the NOTCH signal pathway in the brain glioma stem cells proliferation regulation function.Result:Patients with normal brain tissue protein accumulation NOTCH-1 optical density value was (294.9±29.5),low and highly malignant gliomas NOTCH-1 protein accumulation optical density value was respectively (5046.0±120.9) and (11 026.2±169.1).Low and highly malignant gliomas NOTCH-1 protein expression levels significantly higher than patients with normal brain tissue,and highly malignant gliomas NOTCH-1 protein expression levels was significantly increased than low grade gliomas(P

【Key words】 Human brain glioma stem cells; Proliferation; NOTCH signal; Regulation effect

First-author’s address:The People’s Hospital of Shenzhen City,Shenzhen 518020,China

doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2016.21.005

NOTCH基因从无脊椎动物到脊椎动物,在多个物种中均有表达,其家族成员的结构具有高度保守性,在细胞增殖分化及发育过程中起着关键调节作用[1-2]。目前研究表明,NOTCH-1信号通路在神经前体细胞及神经干细胞的增殖分化中具有重要作用[3-4]。目前对于NOTCH信号对人脑胶质瘤干细胞增殖的调控研究较少,所以进行该研究具有重要价值[5]。本研究采用免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞株中提取、分离人脑胶质瘤干细胞,对细胞进行体外培养,采用荧光定量PCR、免疫组化等方法检测相关指标,观察人脑胶质瘤干细胞增殖中NOTCH信号通路的调控作用,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 此次研究所采用的人脑胶质瘤新鲜标本取自2011年4月-2014年4月于本院进行人脑胶质瘤手术的30例患者,其中14例为低度恶性胶质瘤,16例为高度恶性胶质瘤。另择同期进行颅内减压术20例患者的正常新鲜脑组织作为对照组。本研究采用的U251恶性胶质瘤细胞株和CHG-5胶质瘤细胞株由本院细胞实验室提供。

1.2 方法 (1)细胞培养:胶质瘤新鲜标本及U251、CHG-5细胞株的分选采用免疫磁珠法。将分离出的脑胶质瘤干细胞进行培养,控制每瓶细胞数约为1×105个,向细胞培养瓶内分别加入含血清培养基及无血清培养基,培养温度为37 ℃、二氧化碳浓度为5%,湿度为95%。每隔2天对细胞进行换液处理,培养约5 d左右进行传代。待细胞生长状态良好时进行实验[6-8]。(2)NOTCH-1信号通路相关基因的表达检测:采用Trizol法提取胶质瘤干细胞的总RNA,采用荧光定量PCR法对NOTCH-1信号通路相关基因的表达进行检测,检测的基因包括NOTCH-1、CBF-1、HES-1,内参基因选择GAPDH,实验所采用的引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供,SYBR green由北京康为世纪生物科技有限公司提供。实验结果由荧光定量PCR仪自带软件进行处理分析[9]。(3)NOTCH-1蛋白的表达检测:将人脑胶质瘤组织和正常人脑组织标本送病理科做冰冻切片,然后对NOTCH-1蛋白进行免疫组化染色。免疫组化染色采用SABC法,免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。染色完成后对切片进行显微镜镜检,棕黄色为阳性区域。采用Image Pro Plus 6.0软件测定各切片阳性区域的累积光密度值(IOD)。

1.3 观察指标 观察人脑胶质瘤组织和正常人脑组织中的NOTCH-1蛋白表达情况和人脑胶质瘤干细胞增殖过程中NOTCH-1信号通路的相关基因表达情况。

1.4 统计学处理 使用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计学分析,计量资料以(x±s)表示,比较采用t检验,以P

2 结果

2.1 三组脑组织切片蛋白表达情况比较 在对三组脑组织切片的NOTCH-1蛋白阳性区域分析后得出:正常脑组织的NOTCH-1蛋白累积光密度值为(294.9±29.5),低度及高度恶性胶质瘤患者的NOTCH-1蛋白累积光密度值分别为(5046.0±120.9)和(11 026.2±169.1)。低度及高度恶性胶质瘤患者的NOTCH-1蛋白表达水平较正常脑组织患者明显提高,且高度恶性胶质瘤患者的NOTCH-1蛋白表达水平较低度恶性胶质瘤患者明显提高,比较差异均有统计学意义(P

2.2 人脑胶质瘤干细胞增殖过程中NOTCH-1信号通路的相关基因表达情况分析 收集2株胶质瘤细胞,将从同株胶质瘤中分离得到的CD133-胶质瘤细胞作为参考对照,其中1株来源于病理分型为星型细胞瘤Ⅱ级的患者,另1株来源于病理分型为多形性胶质母细胞瘤Ⅳ级的患者,另外加上U251细胞株和CHG-5细胞株,对4株细胞进行荧光定量PCR检测,结果发现:在CD133+胶质瘤细胞中,NOTCH-1、HES-1及CBF-1基因的表达水平较CD133-胶质瘤细胞明显(P

3 讨论

在临床上,胶质瘤是一种常见的中枢神经系统恶性肿瘤[10]。近年来,胶质瘤患者的发病人数不断增加,且发病率呈不断上升趋势。人脑胶质瘤对于患者而言具有巨大危害,不仅给患者带来了巨大痛苦,对患者的生活质量造成了严重影响,而且该病的治疗效果较差,患者的生存期限较短,仅仅有不到5%的脑胶质瘤患者的生存期可达5年[11-12]。由此可见看出,人脑胶质瘤对患者的生命健康构成了严重威胁[13]。目前,临床上对于胶质瘤患者常采用放疗、化疗、外科手术治疗及免疫抑制治疗等,然而治疗效果常不理想。所以,探讨人脑胶质瘤增殖的信号通路研究可进一步弄清该病的发病机制,可为人脑胶质瘤临床治疗新靶点的选取提供有力参考,对提高该病的治疗水平具有重要意义。

NOTCH基因首次发现于1919年,该基因若发生突变可导致果蝇出现残翅。随着医学研究的不断深入,NOTCH基因被发现存在于无脊椎动物到脊椎动物的多个物种中,并且NOTCH基因家族的成员具有高度保守性。Artavanis-tsakonas等[7]研究表明,NOTCH-1基因不仅在正常细胞的增殖发育过程中起着重要作用,而且与一些脑部肿瘤的发生与发展有着密切联系。除此以外,FAN等[8]研究发现HES-1为NOTCH信号通路的重要基因之一,且该基因在l母细胞瘤患者中的表达水平与患者的治疗及预后密切相关[14]。目前,NOTCH信号通路与胶质瘤发病的研究是一个医学研究热点,探讨NOTCH信号通路对胶质瘤细胞增殖的调控作用,可进一步明确调控机制,可为靶向治疗和基因治疗等新型治疗手段提供理论依据[15-16]。本研究选取了低度、高度恶性胶质瘤患者及正常人脑组织作为标本,进行NOTCH-1蛋白免疫组化分析,结果显示:低度及高度恶性胶质瘤患者的NOTCH-1蛋白表达水平较正常脑组织患者明显提高,且高度恶性胶质瘤患者的NOTCH-1蛋白表达水平较低度恶性胶质瘤患者明显提高,比较差异均有统计学意义(P