APG用于糖尿病皮肤溃疡的治疗

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PRP(富含血小板血浆):制备apg的关键

APG制备的核心环节就是自体PRP的制备。患者外周静脉血经离心、分离、浓缩即可制得PRP。

血浆分离置换法 血浆分离置换法,利用多功能医用血成分自动分离设备通过预设程序在一个封闭系统中离心2次得到PRP或浓缩血小板成分。

Daniel等率先使用血小板分离机制备PRP,并用于整形外科手术切口取得了较好效果。加拿大学者使用血小板分离机PCCS制备PRP可使血小板浓度增加5.5倍。宋扬等进一步改良设备,使得2次离心在同一个容器内完成,简化了程序和污染的机会,制得PRP血小板数量为1 192.88×109/L(浓度增加8.55倍),血小板回收率为59.88%。

这种改良法自动化程度高、操作便捷、不易污染、可控性好、安全高效,制得的PRP中血小板纯度和浓度均高,具有良好的应用前景。但所需血量相对较多,一般>150 ml,或需建立静脉循环通道,在采集血小板后对其他液血成分进行回输。另外,设备昂贵等因素都限制了其推广。

离心分离法制备 人工操作分离PRP差异较大,血小板浓度也不一样。我们研究发现,先以2 000 rpm(313×g力)离心4分钟,用巴氏管吸取上部的血浆及靠近界面1 mm的红细胞转移到另一离心管中;再进一步以4 000 rpm(1 252×g力)离心6分钟,可见在底部薄层的红细胞上沉积有白膜样物质,即血小板沉积层,其上部为含有极少量未沉降血小板的血浆层,用巴氏管吸取上部大部分血浆,剩余部分血浆及血细胞成分;然后在静置30分钟后轻轻振摇离心管,使红细胞和血小板重悬于剩余的血浆中,即得到PRP,其血小板数量为1 363.80×109/L,比离心浓度前提高5.91倍,血小板回收率为75.2%。

袁霆等研究发现有2种方法。即取外周血20 ml,第1次以200×g力离心10分钟,吸取上清液及交界面下3 mm,第2次以200×g力离心10分钟;或第1次以215×g力离心10分钟,第2次以863×g力离心10分钟;以160×g力离心6分钟;所得血小板浓度分别为1 323.80×106/ml和1 347.05×106/ml。

离心分离法对设备要求低,步骤简单,但由于在开放的系统内制备容易受外界污染,并且需在多个容器中转移,增加了血小板激活和被污染的机会。另外,血小板回收率相对较低,且易受操作因素的影响,制备的PRP相关指标变异系数较大。这些缺点使得这一方法的推广应用受到限制。

APG制备过程 APG的制备全过程必须在无菌状态下完成,所有试剂和工具均在灭菌有效期内使用,PRP分离操作间在操作前紫外线消毒。APG制备的主要步骤见下图所示。

APG治疗糖尿病难治性足溃疡的可能机制

APG可加速创面愈合,减少创面疼痛,减少出血和分泌物渗出,但具体机制目前尚不清楚,可能的机制如下。

促进组织再生和修复 研究显示PRP中加入凝血酶和钙剂形成APG后,血小板迅速被激活,活化的血小板被认为是一切组织再生和修复的启动因子和最关键的调节因子。

迄今为止,在接受APG治疗后的创面肉芽组织中已发现多种生长因子和细胞因子水平明显升高,主要包括血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、转移生长因子(TGF)、IGF-1、CTGF、血小板活化因子、β-凝血酶敏感蛋白、抗菌肽、血小板因子4及多种 EGF促进新生血管形成,TGF刺激上皮或瘢痕组织的形成,IGF-1能恢复神经的功能等。而CTGF是组织修复的中心启动因子,能促进软骨细胞、内皮细胞、成纤维细胞趋化、迁移、黏附、增殖和分化;活化血小板α颗粒释出后与细胞膜受体结合而作用于中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞,诱导炎症细胞的聚集、并进一步释放出生长因子、细胞因子和多种蛋白酶;吸引未分化的细胞分布于富血小板凝胶中纤维蛋白支架上,并同未分化细胞的细胞膜结合,调节它们之间的信号传递和启动细胞的分化;促进成纤维细胞、内皮细胞等细胞的增殖、移行,新生血管的形成,进而胶原的沉积和组织的重建。

调节水解蛋白酶的失衡 合并严重细菌感染的溃疡,常伴炎症加重、组织失活,从而诱导产生基质金属蛋白酶(MMP)水平异常增高、MMP/基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)失衡,在失活组织被降解的同时,也破坏大量的生长因子和细胞因子。

我们研究发现APG治疗在一定程度上可降低糖尿病难治性皮肤溃疡肉芽组织中MMP的含量,同时提高TIMP的含量,具有调节糖尿病慢性溃疡中蛋白水解酶失衡的作用。而且,由于APG不仅含有高浓度的活化血小板,同时含有大量纤维蛋白,所以能同时较好地封闭溃疡窦道,填补创面缺损。

对部分菌种的抗菌和抑菌作用 Yeaman等首先对血小板的抑菌作用进行研究,发现其通过释放血小板杀菌蛋白和杀菌趋化因子,直接杀菌活性或诱导白细胞募集,发挥白细胞的抗菌活性。

Bielecki等通过纸片扩散法首次在体外研究中探讨了APG的抑菌作用,结果显示,APG对甲氧西林敏感或耐药的金黄色葡萄球菌、大肠埃稀杆菌均表现出抗菌活性,而对肺炎克雷伯杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌无效。

Moojen等研究也证实APG对金黄色葡萄球菌有抗菌活性。我们通过采用抑菌实验设计,结果提示,APG在体外对金黄色葡萄球菌有较明显的抑菌作用,但未发现对大肠埃稀杆菌及铜绿假单胞菌的明显抑制作用。

APG临床应用安全有效

Krupski WC等通过前瞻性随机双盲安慰剂对照研究,对慢性难治性皮肤溃疡(包括糖尿病性)在常规治疗的基础上分别采用APG和安慰剂治疗,结果发现经治疗12周后,两组间的治愈率分别为24%和33%,提示APG组并没有比安慰剂组获得更多的益处。

Crovetti等使用APG治疗慢性皮肤溃疡24例,其中9例为糖尿病溃疡,治疗后发现局部肉芽组织生长明显加快,所有患者都有完整的上皮形成,并且治疗后局部疼痛明显减轻。David等用APG治疗糖尿病神经性溃疡与传统治疗组相比,试验组患者的皮肤溃疡在治疗前比对照组溃疡面积更大,开放时间更久,溃疡评分更高;32周后观察,试验组的溃疡治愈率显著高于对照组,并且患者普遍易于接受APG治疗。

Driver等通过前瞻性、随机对照研究,将符合纳入标准的72例糖尿病性足溃疡患者随机分为治疗组和对照组,每2周进行1次溃疡评估,疗程12周。治疗后APG组68.4%的患者溃疡愈合,而对照组仅有42.1%的患者溃疡愈合。在校正溃疡面积大小后,APG组81.3%的患者溃疡愈合,而对照组仅有42.1%的患者溃疡愈合。Kaplan-Meier时间愈合曲线显示两组差异有显著性,且未发现有与治疗相关的严重不良事件发生。

研究显示,治疗组在12周内溃疡愈合率达95.7%,而标准治疗组仅为56.5%,两组总有效率分别为100.0%和73.9%。溃疡愈合时间生存分析提示APG治疗组随时间的愈合率明显高于标准治疗组。此外,APG在难治性皮肤溃疡窦道的封闭治疗中显示了更加明显的优势。皮肤溃疡的窦道封闭时间生存分析提示,APG治疗对窦道的封闭率明显优于标准治疗。

应用APG需要注意的问题

APG在治疗糖尿病皮肤溃疡方面表现了良好的效果,但并不是任何情况下使用APG治疗糖尿病皮肤溃疡均能获得成功。使用APG治疗时必须注意以下问题。

APG治疗需建立在糖尿病基础治疗和溃疡局部处理综合治疗的基础之上,如控制患者的高血糖、高血脂、 高血压。

伤口局部的感染也应尽早控制,并选用有效抗生素。

对局部伤口进行彻底清创,将已经坏死的组织和胼胝尽量清除,保持溃疡面平整、清洁,对于较深的窦道或趾缝间等常规清除困难的部位可以使用超声刀等工具辅助清创,消除溃疡周围皮肤水肿。注意患肢减压。

正确评估溃疡肢体的血供情况,溃疡部位缺血严重者要改善局部血供,使用血管重建术或介入手术解除远端供血不足;改变不良生活习惯(如吸烟、饮食等)。

另外,在制备分PRP时,无论使用何种分离方法,最后得到的PRP中血小板含量应>1 000×106/ml,这样才能保证足够浓度的生长因子。在使用APG治疗溃疡时,应该外敷油纱,避免生理盐纱吸附,同时应该密切观察APG治疗后肉芽的生长情况。