宫颈癌组织calpain 6表达及其与微血管密度关系
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【关键词】 宫颈肿瘤；卡配因；微血管密度；免疫组织化学
【摘要】
目的 研究钙激活中性蛋白酶6（calpain 6）在宫颈癌组织中的表达及其与微血管密度（mvd）的相关性。方法 应用免疫组化pv?9000通用二步法，检测calpain 6在10例正常宫颈组织、30例宫颈上皮内瘤变（cin）及65例宫颈癌组织中的表达并计数mvd。结果 calpain 6在正常宫颈、cin、宫颈癌组织中的阳性表达率逐渐升高（h=30.05，p＜0.01)；宫颈癌组织中，临床figo分期晚、分化程度差、有淋巴结转移者calpain 6表达明显高于临床分期早、分化程度好和无淋巴结转移者（χ2=4.068～9.524，p＜0.05），其表达与病人年龄、组织学类型无关；calpain 6表达与mvd呈显著正相关（r=0.946，p＜0.01）。结论 calpain 6可能通过增加肿瘤新生血管形成促进宫颈癌的生长、浸润和转移。
【关键词】 宫颈肿瘤；卡配因；微血管密度；免疫组织化学
expression of calpain 6 in tissue of cancer of the cervix and its relationship with microvessel density
zhao xin?rui, dai shu?zhen, yao qin, et al
(department of obstetrics and gynecology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);
［abstract］ objective to investigate the expression of calpain 6 in cervical intraepithelial neoplasia (cin) and cancer of the cervix (cc) and analyze its association with microvessel density (mvd). methods calpain 6 expression was observed byusing immunohistochemistry pv?9000 technique and mvd counted in 10 cases of normal cervical epithelium (nce), 30 of cin, and 65 of cc. results the positive rates of calpain 6 expression in nce, cin and cc gradually increased (h=30.05,p＜0.01). the expression was significantly higher in patients with cancer at late figo stage, with poor differentiation and lymph node metastasis than that in patients at early stage, with good differentiation and without lymph node metastasis (χ2=4.068-9.524,p＜0.05). the expression of calpain 6 had no significant association with patient’s age and histology type, but was positively correlated with mvd (r=0.946,p＜0.01). conclusion the results suggested that calpain 6 enhances tumor growth, infiltration and metastasis via an increase of tumor neovascularity.
［key words］ cervix neoplasms; calpain; microvessel density; immunohistochemistry
宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，易转移及复发。肿瘤分子生物学研究表明，肿瘤的发生、发展和转移是一个多阶段、多因素、受多种基因及因子调控的复杂过程，其中任何一种基因或因子的异常表达均可导致恶性肿瘤的发生或转移。钙激活中性蛋白酶6（calpain 6）属于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成员之一，近年来的研究显示，在多种肿瘤组织中均可检测到calpain 6基因高表达，其对肿瘤发生可能有潜在的促进作用，但具体机制并不明确[1]。本研究通过检测calpain 6在宫颈癌组织中的表达情况，探讨其与宫颈癌生物学行为之间的关系及其与微血管密度（mvd）的相关性，以了解calpain 6在宫颈癌发生、发展及预后中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2005年1月—2007年12月,收集我院妇科手术宫颈癌组织标本65例，病人年龄28～66岁，平均（49.37±8.73）岁。其中鳞癌48例，腺癌17例；根据国际妇产科联盟（figo）2000年修订临床分期标准，ⅰ期36例，ⅱ期24例，ⅲ期5例；高分化13例，中分化28例，低分化24例；有淋巴结转移者16例。宫颈上皮内瘤样病变（cin）组织标本30例（均取自宫颈锥切或子宫全切标本），根据《妇产科学》第6版诊断标准，cinⅰ6例， cinⅱ9例， cinⅲ15例。另取子宫肌瘤或其他妇科良性疾病病人的正常宫颈组织标本10例作为对照。所有病例获取标本前均未接受过放疗及化疗，均经病理检查证实诊断。
1.2 calpain 6表达及mvd检测方法
采用免疫组化pv?9000通用二步法，试剂盒由北京中山金桥生物技术有限公司提供。具体步骤按试剂盒说明操作。用已知的阳性切片作为阳性对照，以pbs代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判断
calpain 6蛋白以细胞质和（或）核内出现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数≤5%为0分， 6%～25%为1分， 26%～50%为2分， >50%为3分；细胞染色黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。采用半定量积分法判定结果，综合评分由阳性细胞数评分和细胞染色评分相乘判断：0分为阴性（-）， 1～2分为弱阳性（+），3～4分为阳性（?）， 5～6分为强阳性（?）。mvd计数参照weidner方法，每个被染成棕黄色孤立的内皮细胞，条索状、裂隙状、管状细胞团，只要与邻近组织分开，即可视为一个微血管。肿瘤内硬化区内的微血管不计数。
1.4 统计学方法
采用spss 16.0及ppms 1.5[2]统计学软件进行数据处理，数据间比较采用秩和检验、χ2检验、t检验和方差分析，相关性用spearman等级相关分析。p＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 各种组织中calpain 6表达和mvd的比较
正常宫颈、cin、宫颈癌组织calpian 6的表达阳性率逐渐升高，三者间比较差异有统计学意义（h=30.05，p＜0.01）。正常宫颈、cin和宫颈癌组织中的mvd亦逐渐升高，三者间比较差异有显著意义（f=25.77，p＜0.01）。见表1。表1 各种组织中calpain 6表达和mvd的比较（略）
2.2 宫颈癌组织中calpain 6表达、mvd与临床病理参数的关系
宫颈癌组织中，临床figo分期晚、低分化、有淋巴结转移者calpain 6表达明显高于临床分期早、中高分化和无淋巴结转移者（χ2=4.068～9.524，p＜0.05），但其表达与病人年龄、组织学类型无关（χ2=0.668、0.216，p＞0.05）。宫颈腺癌mvd较鳞癌高（t=2.855，p＜0.05），低分化宫颈癌mvd高于中分化和高分化（t=5.506、5.464，p＜0.05），淋巴结转移组mvd显著高于未转移组（t=6.155，p＜0.05），分期晚者mvd显著高于分期早者（t=3.674，p＜0.05），但mvd与病人的年龄无关（p＞0.05）。见表2。表2 calpain 6表达、mvd与宫颈癌临床病理参数的关系（略）
2.3 宫颈癌组织calpian 6表达与mvd的相关性
calpain 6表达阴性者和阳性者的mvd分别为12.08±1.16、25.09±5.99，二者比较，差异有显著性（t=7.44,p<0.01）。相关分析显示，calpain 6在宫颈癌组织表达与mvd呈正相关（r=0.946，p＜0.01）。
3 讨论
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率及病死率在我国呈上升趋势，其发生、发展是一个多基因、多阶段的演进过程。dear等[3]1997年在小鼠的基因组中发现了calpain 6，calpain 6属于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成员之一，位于人x染色体q23，是该家族中惟一一个在性染色体上编码的基因，包含11个内含子，一个大开放阅读框，编码641个氨基酸，氨基酸序列与其他家族成员有相似性，但是calpain 6是一种不典型的半胱氨酸蛋白水解酶，它所编码的氨基酸序列中只有3个保守活性位点（cys81，his252和asn284）中的一个（asn284），半胱氨酸活性位点被81位的赖氨酸代替，组氨酸被252位的酪氨酸代替。其表达具有组织特异性，胚胎时期在各组织中广泛分布，出生后表达水平下调，成人仅表达于胎盘组织[3]。近年来研究结果显示，calpain 6参与细胞骨架的重构、微血管的稳定、细胞凋亡的抑制，可能有促进肿瘤发生的作用。
本文研究显示，calpain 6在正常宫颈、cin 和宫颈癌组织中的表达阳性率依次升高，差异有统计学意义，提示calpain 6在宫颈癌的演进发展中起着重要的作用。本研究结果还显示，随着figo分期的增高，calpain 6表达率升高；低分化组calpain 6表达明显高于中、高分化组；有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者。说明肿瘤临床分期越晚，组织分化程度越差，向远处转移的概率越高，calpain 6表达越高。另外，本实验mvd计数结果显示，正常宫颈、cin和宫颈癌组织的mvd逐渐升高，说明在宫颈癌发生过程中微血管生成起重要作用，且calpain 6在宫颈癌组织中的表达与mvd呈高度正相关，说明calpain 6可能通过增加肿瘤新生血管形成促进肿瘤生长、浸润和转移。
calpain 6是calpain家族中惟一一个羧基端缺乏钙调蛋白样结构域的亚型，其结构表明它可能没有蛋白水解作用或者通过其他的位点发挥水解作用[4?6]。skubitz 等[5]和lee等[6]曾先后在子宫肉瘤和平滑肌瘤组织中检测到calpain 6高表达，但至今没有研究能阐明其致瘤机制。随后，mellgren等[7]分别建立高表达calpain 6和抑制其表达的人宫颈癌细胞hela细胞系和脐静脉内皮细胞系，结果表明，calpain 6促进肿瘤发生。这与本研究的结果相符合。
本研究还显示，calpain 6的表达与mvd呈正相关，mvd是反映肿瘤血管生成最直观最便捷的指标。血管生成是实体肿瘤生长和转移的必要条件之一。血管为肿瘤的增殖提供营养,亦为肿瘤的转移提供通道。肿瘤新生血管结构缺乏完整性,癌细胞易穿透,有利于癌细胞的转移。tonami等[1]研究表明，calpain 6参与微血管的稳定以及细胞骨架的重构，而内皮细胞的活性在调节血管生理功能及疾病方面起着重要的作用，包括肿瘤的生长和维持，所以，calpian 6可能是通过促进内皮细胞的迁移和侵袭来调节血管生成和管道形成的。
综上所述，calpain 6可能通过增加肿瘤新生血管形成促进宫颈癌的生长、浸润和转移，检测其表达有助于了解肿瘤的侵袭性、判断肿瘤的发展程度及预测肿瘤的复发倾向。同时，calpain 6还可作为肿瘤治疗新的分子靶点，为肿瘤的生物学治疗提供新的思路和途径。
【参考文献】
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[6] lee s j, cho y l, lee e j, et al. increased expression of calpain 6 in uterine sarcomas and carcinosarcomas: an immunohistochemical analysis[j]. int j gynecol cancer, 2007,17:248?253.
[7] mellgren r l, lane r d. myocardial calpain 2 is inhibited by monoclonal antibodies specific for the small, noncataly?tic subunit[j]. biochim biophys acta, 1988,954:154?160.