再灌注早期渐增灌注压力对缺血再灌注心肌保护作用的实验研究

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【摘要】 目的 探讨心肌缺血后再灌注时渐增灌注压力是否具有与标准心肌缺血后处理相同的心肌保护用以及其机制。方法 观察持续缓慢升高灌注压力对缺血再灌注后心肌的冠脉流出液中cTnI含量及冠脉流量、心肌细胞超微结构变化的影响以及P-Akt的表达。结果 持续缓慢升压组能有效促进缺血再灌注心脏的冠脉流量恢复，冠脉流出液中cTnI含量减少，P-Akt高表达,同时电镜观察显示细胞超微损伤亦减轻。结论 持续缓慢升高灌注压力对离体缺血再灌注心脏具有保护作用，PI3K/Akt/GSK-3β通路可能是其心肌保护作用的信号传导通路之一。

【关键词】 缺血再灌注损伤；渐增再灌注压力；缺血后处理；P-Akt

The study of cardioprotective effects of reperfusion initial period increasing perfusion pressure on isolated rat heart suffering from ischemia and reperfusion

LI Qing-zhi, LI Xin, ZHU Hu-jun, et al.

Thoracicsurgery of Deaing oil field Hospital

【Abstract】 Objective To discussion after myocardial ischemia reperfusion when whether perfusion pressure increasing with standard myocardial ischemia post-processing same myocardial protection to and its mechanism. Methods Observed for slow rise perfusion pressure after myocardial ischemic reperfusion coronary outflow fluid cTnI levels and coronary flow, myocardial ultrastructure of change and influence of P-Akt expression. Results Continued slow pressor group can promote effectively the ischemia-reperfusion heart coronary flow recovery, coronary outflow cTnI levels decrease in liquid, P-Akt high expression, and electron microscopic observation shows cells also reduce damage ultrastructure.Conclusion Continue to slow rise perfusion pressure vitro ischemia-reperfusion heart protective, PI3K/Akt/GSK-3βpathways are probably the myocardial protection of signaling pathways that one.

【Key words】 Ischemia reperfusion injury；Increasing pours into the pressure again；Ischemia postconditioning；P-Akt

减轻或消除心肌缺血再灌注损伤(MIRI)一直是临床研究的热点，2003年,Zhao［1］等首先提出经典缺血后适应(Ischemic postconditioning，IPO)概念，并认为其心肌保护机制可能与蛋白激酶B(P-Akt)的激活有关［2］。本实验拟探明一种后处理的改良方法，即再灌注时，使灌注压力逐渐缓慢的达到正常灌注压水平，探讨这种再灌注时的“缓处理”是否具有与标准缺血后处理相同的心肌保护用以及其可能的分子机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物及模型制作 健康SD大鼠，6周龄，雌雄不拘，体重200～300 g。10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，腹腔注射肝素(500U/kg)，快速取出心脏并悬挂于Langendorff心脏灌注装置上，K-H液平衡灌流30 min。

1.2 实验分组和灌注方案 将52只SD大鼠，随机分成4组，分为如下四组：(1)空白组(NC组)：平衡灌流120 min, 灌注压为80 cmH2O；(2)对照组(缺血再灌注组，I/R组)：缺血30 min，再灌注1 h，灌注压为80 cmH2O；(3)缺血后适应组(IPO组)：缺血30 min，再灌注前1 min内,迅速给予短暂复灌流10s,停止灌流10s，此为1个循环,重复3个循环，每次灌注压为80 cmH2O，再灌注持续灌注59 min，灌注压为80 cmH2O；(4)改良缺血后适应组(L-IPO组)：缺血30 min，再灌注前1 min内,给予持续低压灌流，第一个20s内灌注压力为20 cmH2O，第2个20s内灌注压力为40 cmH2O,第3个20s内灌注压力为60 cmH2O，再灌注59 min，灌注压为80 cmH2O。

1.3 标本留取和指标检测

1.3.1 冠脉流量(CF)测定 记录缺血前(Base)、再灌注5 min(R5)、15 min(R15)、30 min(R30)、60 min(R60)时1 min冠脉流量(CF)。

1.3.2 冠脉流出液中心肌钙蛋白(cTnI)含量测定 于 Base、 R5、R15、R30、R60时留置各个时点冠脉流出液5 ml，检测心肌钙蛋白(cTnI)。

1.3.3 电镜标本的制作 灌流结束后，取左室心尖部全层心肌标本，1200EX透射电镜观察超微结构变化。

1.3.4 Western blot法检测磷酸化蛋白激酶B表达状态 灌注结束后心肌组织匀浆，电泳分离，转印，覆膜，加入P-Akt一抗、二抗孵育，洗膜，显色，结果量化，以actin的蛋白含量作为内参。

1.4 统计学方法 数据以均值±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，率比较采用χ2检验，两两比较采用S-N-K检验，以P

2 结果

2.1 IPO及L-IPO对冠脉流量的影响 与NC组相比，I/R组CF减少(P

2.2 IPO及L-IPO对冠脉流出液中cTnI含量的影响 再灌注后IPO组及L-IPO组冠脉流出液中cTnI含量与NC组相比差异有统计学意义(P

2.3 IPO及L-IPO对心肌细胞超微结构的影响NC组 心肌结构基本正常。I/R组：心肌线粒体普遍肿胀，空泡化，嵴模糊，稀疏，肌丝成分溶解、减少，肌纤维肌节紊乱，Z线不清。IPO组：线粒体轻度肿胀，少数中度肿胀，肌丝轻度稀疏，肌丝排列基本整齐，Z线略模糊。L-IPO组：电镜超微结构改变与IPO组相似。

2.4 各组中大鼠离体心脏缺血再灌注结束后P-Akt的蛋白表达 各组心肌中均有P-Akt表达，但灰度值测定结果显示I/R组(45.2±3.4)与N组(45.7±3.5)差异无统计学意义(P>0.05)，IPO组(71.5±4.8)与L-IPO组(70.8±4.8)P-Akt表达水平较I/R组(45.2±3.4)显著升高(P

3 讨论

冠脉再通后，心肌组织再灌注并不完全、冠脉流量减少，甚至无再灌注，称为心肌无再流现象［3］。本实验研究看出， L-IPO能够促进离体缺血再灌注心脏的冠脉流量的恢复，减少由于灌注压的突然及快速升高引起的血管应力的改变，以免因血管内皮过度扩张和液体的外渗而引起心肌组织损伤和水肿［4］，改善缺血心肌的灌注，可能避免或减轻心肌微循环障碍及无复流现象。

线粒体是心肌进行细胞能量代谢的主要细胞器，心肌纤维是心肌主要功能单位。MIRI损伤的主要靶细胞器是线粒体，缺血后处理的保护性通路似聚于线粒体。本实验通过对心肌超微结构形态学观察证实， L-IPO组心肌超微结构病变明显减轻，表现在线粒体结构完整，仅轻度肿胀，肌丝排列基本整齐，肌丝轻度稀疏，Z线较清，肌纤维排列较整齐，有效的维护心肌细胞超微结构的稳定。

Zhao等发现缺血后处理的保护作用主要得益于它对再灌注最初阶段的影响［5］。与IPO相似,L-IPO也是对再灌注最初阶段产生影响。因此,L-IPO只是一种改良的后处理,而非一种新的心肌保护方式。本实验设计的L-IPO由于不附加额外的缺血,并减少了对血管的操作，避免了斑块脱落、破裂，血管夹层的发生及相关并发症的产生，与IPO相比,L-IPO方式可能更容易被临床工作者接受。

Tsang等［6、7］通过研究分析发现IPO诱导Akt磷酸化的增强，在使用PI3K抑制剂后，IPO介导的Akt磷酸化被终止，保护作用同时被取消，据此推测心脏再灌注损伤保护激酶(RISK)通路的激活在IPO中可能起到重要的作用。我们研究发现IPO使心肌细胞再灌注阶段P-Akt表达增加，与I/R组相比有显著性差异，与Tsang报道相同，这提示L-IPO同IPO一样，对MIRI具有的保护作用是可能是通过心脏再灌注损伤保护激酶(RISK)通路的激活参与介导完成的，即PI3K/Akt/GSK-3β通路可能是L-IPO对大鼠离体心脏MIRI保护作用的信号传导通路之一，这与IPO机制相同或相似。

参 考 文 献

［1］ Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003,285(2):H579-H588.

［2］ Argaud L, Odile GR, Raisky O, et al. Postconditioning Inhibits Mitochondrial Permeability Transition.Circulation, 2005,111:194-197.

［3］ Yellon DM,Alkhulaifi AM，Pugsley WB, et al. Preconditioning the human myocardium. Lancet, 1993, 342:276.

［4］ Tsang A, Hausenloy DJ,Mocanu MM, et al. Postconditioning:a form of“modified reperfusion” protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol-3 kinase-Akt pathway.Circ Res,2004,95:230-232.

［5］ Kin H, Zhao ZQ, Sun HY, et al. Postconditioning attenuates myocardial ischemia reperfusion injury by inhibiting events in the early minutes of reperfusion.Cardiovasc Res, 2004, 62(1):74-85.

［6］ Tsang A, Hausenloy DJ, Mocanu MM, et al. Postconditioning a form of "modified reperfusion" protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway.J Am Coll Cardiol,2004,44(5):1103-1110.

［7］ Schwartz LM. Ischemic postconditioning during reperfusion fails to protect against lethal myocardial ischemia-reperfusion injury in pigs.Circulation,2004,110 (suppl Ⅲ):106.