鹿产品中胶原蛋白的研究
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《经济动物学报》2014年第二期
1．1鹿茸中提取胶原蛋白鹿茸是雄性马鹿(CervuselaphusLinnaeus)或梅花鹿(CervusnipponTemmick)未骨化的、密生的、茸毛的幼角，始载于《神农本草经》。鹿茸“味甘、性温、主漏下恶血、寒热惊痫、益气强志、生齿不老”。对多种鹿茸中化学成分的分析表明［11-13］:鹿茸中含有大量的I型胶原。鹿茸中粗蛋白质含量占干重质量50%以上，而胶原是鹿茸中含量最高的蛋白质。鹿茸具有可再生、生长速度快的特点，药理作用广泛，因此鹿茸作为胶原提取原料具有其他原料无法比拟的特点。徐云凤等［14］采用胰蛋白酶水解制备鹿茸胶原蛋白，运用正交试验法考察胶原蛋白的提取工艺，用高效凝胶色谱法考察胶原蛋白的酶解条件，优选出提取鹿茸胶原蛋白的最佳工艺:料液比为1∶3(g/mL)，水煮时间4h，提取5次，胰蛋白酶与底物(鲜鹿茸)比1∶5000，酶解时间2h，得出鹿茸胶原蛋白收率为12.52%，蛋白含量为56.89%。赵玉红等［15-16］采用胃蛋白酶法提取鹿茸中的胶原，运用Box-Behnken中心组合试验设计优化胶原提取条件:提取时间52h、酶用量5%、液料比为1∶23(g/mL)。试验结果表明，二杠茸中胶原含量和得率分别为65.8mg/g和4.53%，均高于毛桃茸和三杈茸。采用胃蛋白酶法在酸性条件下制备的梅花鹿鹿茸胶原在波长230nm处具有强特征峰;红外图谱证明提取的鹿茸胶原为Ⅰ型胶原;含有17种氨基酸，其中甘氨酸含量最高，其次为丙氨酸和脯氨酸，酪氨酸、蛋氨酸和组氨酸含量较低;其热收缩温度为84.05℃，高于一般脊椎动物的热收缩温度;具有完整的三螺旋结构。李银清等［17-18］采用醇提法制备鹿茸胶原，得出鹿茸醇提物中主要含有Ⅰ型胶原，含量约70%;相对鲜鹿茸，胶原提取率为10.3%。醇提法制备的鹿茸胶原中含有18种氨基酸，其中甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量最高，组氨酸和酪氨酸含量较低。对鹿茸胶原酶解物进行药效学研究结果表明，鹿茸胶原酶解物具有免疫调节、抗炎、抗应激作用［19-20］。同时，鹿茸胶原对大鼠成骨细胞有明显的促贴壁和增殖作用，对雌性大鼠骨质疏松症具有一定的治疗作用［21］。
1．2鹿筋中提取胶原蛋白鹿筋是贵重的动物类中药，是鹿科动物马鹿(CervuselaphusLinnaeus)或梅花鹿(CervusnipponTemmick)的四肢干燥筋。始载于《唐本草》［22］，性温，味淡微咸，主要用于治疗风湿关节痛、手足无力、肾虚、大壮筋骨、转筋及劳损等症，临床上主要用于治疗肩周炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、风湿性关节炎、风湿等［23］。鹿筋是一种营养保健价值较高的补品，现代研究表明，胶原蛋白是鹿筋的主要成分。从鹿筋中提取胶原蛋白的常规方法是将新鲜的鹿筋去筋膜、皮及脂肪后，用生理盐水反复清洗去除脂肪和血，再用蒸馏水冲洗干净以备用。张鹤等［24-25］对鹿筋用石油醚脱脂、4%的盐酸脱钙后，采用醋酸浸泡、100℃沸水浸提、胃蛋白酶酶解，运用单因素试验和正交试验筛选出提取鹿筋胶原蛋白的最佳条件:醋酸体积分数为5.5%、料液比为1∶7(g/mL)、浸提时间14h，胃蛋白酶与底物比1∶1000、酶解时间24h。采用盐酸浸泡、100℃沸水浸提、胰蛋白酶酶解，运用单因素试验筛选出提取鹿筋胶原蛋白的最佳条件:盐酸质量浓度为0.2%，料液比为1∶12(g/mL)，浸提时间48h，胰蛋白酶与底物比为1∶8000，酶解时间3h。试验结果表明，鹿筋胶原蛋白收率分别为74.56%和82.12%;蛋白含量分别为65.54%和72.25%。从试验结果可以看出，采用胰蛋白酶酶解鹿筋胶原蛋白得出的胶原蛋白收率和蛋白含量较高。Takeshi等［26］通过胃蛋白酶酶解制备梅花鹿鹿筋胶原，得出的胶原蛋白的产量相当于鹿筋冷冻干燥后质量的37.5%。红外光谱分析显示，从鹿筋中提取的胶原蛋白的二级结构与猪皮、牛皮中提取的胶原蛋白不同。孙晓迪等［27-28］对鹿筋胶原蛋白进行药理学研究，结果表明，鹿筋胶原蛋白具有免疫调节、抗炎作用。同时，鹿筋胶原蛋白还对弗氏佐剂诱导的大鼠佐剂性关节炎有明显的治疗作用。曲毅等［29］对鹿筋胶原蛋白进行药理学研究，结果表明，鹿筋胶原蛋白具有明显抗炎、镇痛作用。张鹤等［30］研究鹿筋胶原对维甲酸诱导的大鼠骨质疏松模型的治疗作用，结果表明，鹿筋胶原蛋白对维甲酸导致的骨质疏松症具有较好的防治作用，同时也为临床上治疗骨质疏松方面的新药开发提供了理论基础。
1．3鹿骨、鹿角盘中提取胶原蛋白鹿骨是鹿科动物马鹿(CervuselaphusLinnae-us)或梅花鹿(CervusnipponTemmick)的骨骼。鹿骨的药用被首载于《名医别录》。现代研究表明，鹿骨胶具有祛风除湿、益气补血、补肾壮阳的功能，对四肢疼痛、风湿、贫血、精髓不足、久病体弱等症临床疗效较好。鹿骨是养鹿业的副产物，富含胶原蛋白，约占57%。鹿角盘是雄性鹿科动物马鹿(CervuselaphusLinnaeus)或梅花鹿(CervusnipponTemmick)在每年的7、8月份，鹿茸被割下以后自然生长出来的形状不一、十分坚硬的盘状物质，待到第2年的4、5月份自然脱落。鹿角盘中含有大量的胶原蛋白，是鹿角霜、鹿角胶的原料［31］。因此，对鹿骨、鹿角盘的开发利用，是增加养鹿业经济效益的有效途径之一。由于鹿骨和鹿角盘都属于骨类，质地坚硬，从中提取胶原蛋白一般采用高温浸提或酒制的方法。粗提得到的胶原蛋白为明胶，低温放置仍具有凝胶性，分子量在几万到十万，不易被人体消化利用，因此常进行酶解，酶解得到胶原蛋白分子量在几千到几万。从鹿骨和鹿角盘中提取胶原蛋白的常规方法是预处理(脱脂、脱钙)、溶胶(高温浸提)、酶解(蛋白酶切除胶原的末端肽)。赵玉红等［32-34］利用Alcale碱性蛋白酶对鹿骨进行水解的最佳酶解条件为水解温度65℃、水解时间135min、pH值为9、酶用量3500U/g。在此条件下得出鹿骨胶原蛋白的水解度为12.2%，•OH自由基的清除率70.8%。研究表明，鹿骨胶水解物蛋白具有较强的体外抗氧化作用。他们还采用酸和酶提取法从鹿骨中提取酸溶性胶原蛋白(C)和胃蛋白酶促溶性胶原蛋白(PSC)，通过紫外扫描分析得出鹿骨的C和PSC在234nm处均有强烈吸收，具有胶原蛋白的特性;通过红外光谱分析说明胶原纤维保留了大量的三股螺旋结构;经DSC测定，鹿骨的C和PSC热收缩温度分别为55℃和58℃。SDS－PAGE电泳显示，胶原蛋白含有3条不同的链，α1、α2和β链。张鹤［35］采用单因素试验和正交试验优化，得到鹿骨胶原蛋白提取的最佳工艺:料液比1∶5(g/mL)，水煮3.5h，水煮3次;采用SDS－PAGE确定胰蛋白酶的用量为酶与底物比1∶5000，酶解1h，提取率为5.11%，蛋白含量约80.59%。采用单因素试验和正交试验优化得到提取鹿角盘胶原蛋白的最佳工艺:料液比1∶5(g/mL)，水煮5h，提取4次;采用高效液相凝胶色谱法确定胰蛋白酶的用量为酶与底物比1∶10000，酶解1.5h，收率为22.31%，平均蛋白含量66.32%。氨基酸分析表明，鹿骨胶原蛋白和鹿角盘胶原蛋白中均含有17种氨基酸，其中甘氨酸含量最高，分别为33.87%和31.51%，这表明运用此方法水解得到的胶原蛋白中各成分均没有受到破坏，依然保存胶原蛋白的特点。牛放等［36］采用热水浸提，胰蛋白酶酶解，得到鹿角脱盘胶原蛋白，采用Folin－酚试剂法测定鹿角盘胶原蛋白中蛋白含量约为66%。试验结果表明，鹿角盘胶原蛋白对去卵巢所致的骨质疏松大鼠有一定的治疗作用。
1．4鹿皮中提取胶原蛋白鹿皮是鹿科动物马鹿(CervuselaphusLinnae-us)或梅花鹿(CervusnipponTemmick)的皮，它是梅花鹿系列产品中的一个重要组成部分。《本草纲目》中记载鹿皮“补气，涩精，敛疮”。《四川中药志》收录:“性温，味咸，无毒，能补气，涩虚滑。治妇女白带，血崩不止，肾虚滑精;涂一切疮。”王建辉等［37］采用酸法和酶法从东北特产梅花鹿鹿皮中提取胶原蛋白，其中，酶法提取的胶原蛋白含量高于酸法的1.5倍，而且纯度较高。酶法提取鹿皮胶原蛋白中蛋白质含量为81.4%，鹿皮胶原的相对分子量分布为(11.7～21.4)×104，饱湿倍数、吸水倍数分别为20、2.4，等电点为4.19。鹿皮胶原蛋白中含有18种氨基酸(谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的含量较高)和21种人体所必需的微量元素(其中Zn、Ge、Se的含量较高，分别为93.4，0.56，0.01μg/g)。
2鹿产品胶原蛋白的应用现状
2．1在食品、保健品行业的应用胶原蛋白本身可以作为一种食品，食用胶原蛋白一般来源于动物的肌腱、真皮和骨骼，但多数情况下，胶原蛋白在食品方面主要是营养和功应用两方面［38］。人们食用富含胶原蛋白的食品，能够有效地增强体质、强筋健体、延缓机体衰老［39］。在古代，我国食用鹿产品在诸多典籍中均有记载，近现代，鹿产品食用有了更大的发展，食用鹿产品几乎包括其全部品种，鹿产品早已成为中餐的重要组成部分以及最受消费者欢迎的门类之一。药理学研究表明，鹿筋、鹿茸、鹿角盘等酶解产物均具有抗氧化、抗疲劳和提高免疫功能的作用。但是，由于鹿产品在保健食品、预包装食品和中医药膳食疗领域的应用受到现行体制及相关的法律、法规政策的限制，仅有少数品种审批上市。
2．2在化妆品行业中的应用胶原蛋白具有纯天然的防皱、祛斑、美白保湿等作用，胶原蛋白广泛应用于化妆品中主要有亲和性、保湿性、修复性、营养性及配伍性等功效。在化妆品工业中，胶原蛋白作为化妆品原料的有效性已经确定。胶原蛋白可从动物皮中提取，其中，从鹿皮中提取的胶原蛋白具有较强的吸水性和饱湿性，利用这一性质，可以用于化妆品生产。研究表明，鹿皮胶具有特有香气，鹿皮胶营养液具有养颜、润肤作用［40-41］。鹿产品中鹿皮、鹿筋、鹿茸等都含有丰富的胶原蛋白，我国古籍中有许多鹿产品用于美容化妆的记载，如“永和公主澡豆方”《太平圣惠方》中的鹿角胶、鹿角霜;“小地黄煎丸”《圣济总录》中的鹿角胶等［42］。现在市场上也不断有鹿产品为原料的高档美容化妆品上市，如鹿胎素化妆品、康鹿鹿茸养颜宝、鹿脂蛋白乳等，不断满足消费者对天然、高档美容化妆品的需求。
2．3在医疗卫生行业中的应用胶原蛋白是细胞重要的组成成分，可构成细胞外基质的骨架，胶原蛋白能防止血栓、保持血管壁弹性、提高韧带及软骨的、减轻关节僵硬等，其在治疗真皮缺陷或损伤、美容整形、增强机体免疫力等方面的作用已被认可。我国是世界上最早将鹿产品列入药用的国家，但是《中华人民共和国药典》仅将鹿茸、鹿角及鹿角制品鹿角胶、鹿角霜4种鹿产品列入法定中药材，在民间，我国应用鹿花盘治疗儿童腮腺炎及肿块等疾病具有较悠久的历史。鹿角盘中具有丰富的蛋白质及多肽;临床上，鹿角盘胶原蛋白具有治疗骨质疏松、乳腺增生等作用。张金宝［43］报道了1例鹿角盘治疗胃癌晚期患者的病例，2年后痊愈。张维滋等［44］通过146例临床观察证实，鹿花盘注射液对乳腺增生的良好疗效。药理研究结果表明，鹿茸胶原多肽可以应用于治疗骨质疏松［45］、成骨细胞生长［21］、组织修复［46］、乳腺增生等，鹿茸液能够减少CHF大鼠心肌细胞凋亡，从而抑制左室重构，具有良好的临床研究前景［47］。
3小结
随着生活水平的提高，人们追求健康的意识逐渐加强，胶原蛋白的美容、保健功效越来越受到人们的青睐。鹿科动物也是哺乳类动物中最富有价值的动物。鹿产品具有极高的药用价值和保健功效。鹿的人工养殖技术已经成熟，现有鹿产品已经脱离对野生动物资源的依赖。利用人工生产的鹿产品可以作为提取胶原蛋白的一种新型原料来源应用于食品、化妆品及医疗卫生领域。而且，我国是世界上产鹿种类最多的国家，也是人工养鹿业的开拓者。从世界范围来看，养鹿业已经成为一个新兴的产业，相信随着科学的发展、技术的进步，鹿产业将带来更好的经济、社会和生态效益。
作者：卫功庆刘少华陈大勇范宁赵岩张连学单位：吉林农业大学中药材学院