蜘蛛丝特性及利用生物工程技术生产蛛丝蛋白的研究

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[摘 要]蜘蛛丝由于其复杂的结构组成而具有优异性质，作为一种天然材料在众多领域都具有巨大的应用潜力。但由于蜘蛛难以大规模养殖、蛛丝生产量小等问题，蛛丝纤维无法进行大批量生产。许多科学家开始着眼于通过植物、动物、微生物等载体，运用生物工程技术，进行蛛丝纤维的大规模生产。本文对蛛丝纤维的理化特性及生物工程制备蛛丝的研究进行简要阐述。

[关键词]蛛丝蛋白；生物工程；家蚕；大肠杆菌

中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）09-0296-02

1.蜘蛛丝的特性与应用

1.1 蜘蛛丝的组成与结构

蜘蛛丝是由蜘蛛的蜘蛛丝腺体所分泌的一种高分子蛋白纤维，具有许多优良的机械性能。蜘蛛丝具有光滑的外表，呈现金色光泽；其内部结构透明致密，横截面近似圆形。蛛丝纤维的芯层含有伸展状微管，这些微管对其物理性质具有重要影响。蜘蛛丝主要由蛋白质构成。蛛丝蛋白含大约7种氨基酸，分别是甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、亮氨酸和精氨酸，这7种氨基酸的总含量约占氨基酸总量的90%[1]，具体含量因蜘蛛种类差异而有所不同。

结晶状态部分和非结晶状态部分是蛛丝蛋白的主要组成部分。结晶状态区域主要由丙氨酸链组成，这些多聚丙氨酸链形成有序的β―折叠片层，β-折叠片层反向平行排列，层与层以氢键结合，形成了复杂的多层结构。片层之间的区域为非结晶状态的蛛丝蛋白。非结晶状态的部分富含由甘氨酸形成的α―螺旋结构，将结晶区连接起来。结晶区片层之间的氢键使得各层之间的结合十分紧密。由于结晶区β―片层在纤维轴线方向上有序排列，使得蛛丝在受力时，外力均匀分散在众多丙氨酸链上[2]，因而蜘蛛丝的韧性较好。

1.2 蛛丝蛋白的应用

蜘蛛丝的成分与结构决定了其具有优秀的特性，如轻便，强度大，弹性好，不易断裂，耐干耐潮等等。此外，由于可降解，蜘蛛丝还是一种对环境友好的材料。这些特性使得蜘蛛丝在许多重要领域有重要的应用价值：在医学方面，可用于制作人工关节、韧带、假肢、可降解伤口缝合线等生物材料；在军事方面，可用于制造防弹背心、载具装甲、高强度降落伞等； 在工业中，蜘蛛丝可用于制作高强度材料、纺织材料等； 在建筑方面，可用于制造施工建筑所使用的结构材料等。

由于蜘蛛属于肉食动物，有同类相食的习性，无法像普通畜类一样进行大规模养殖；此外，单个蜘蛛产丝效率低，提取难度高，因而生产蛛丝成本巨大。但是，随着生物科学的进步，人类对蜘蛛丝蛋白基因组成的破译取得进展。在破解蜘蛛丝蛋白基因的编码信息后，我们就可以自主编辑基因片段，利用生物工程，使用其他载体合成蜘蛛丝蛋白，以大批量生产高性能纤维材料。

2.蛛丝蛋白的生物工程制备方法

2.1 植物载体法

植物能够自主合成氨基酸，免除额外提供的麻烦，且植物基因较为稳定，不易出现插入片段失效的问题。故随着生物工程技术的发展，许多科学家尝试在植物DNA中插入重组基因，培育出能够合成蜘蛛丝蛋白的新品种。例如，将重组蜘蛛丝基因转入马铃薯和烟草等植物中，使之能够较高效地生产出蜘蛛丝蛋白类似物。用这样所得到的原料制造纤维，比起直接收集蜘蛛丝，产量将大幅提高，成本也⒋蟠蠼档汀R虼耍若是能够培育出像这样可以合成蛛丝蛋白的新品种作物，量产蜘蛛丝纤维将成为可能。

2001年Scheller等首先成功合成编码络新妇属蛛丝蛋白的同源cDNA，然后与编码家蚕丝素重链基因的一个片段融合，以使蛛丝蛋白兼具蚕丝的优良性能。他们将合成的融合基因插入特定的载体中，并将构建好的载体分别转化进烟草和马铃薯中。经检测，由420～3600个碱基对编码表达的重组蜘蛛丝蛋白占烟草、马铃薯叶片和马铃薯块茎中可溶性蛋白的2%以上，且与天然蜘蛛丝蛋白具有约90%的同源性。同时发现在此种载体中，分子量大于100kDa的蜘蛛丝蛋白也能在植物体中正常表达，并且表达水平不受基因大小的影响。高分子质量的蜘蛛丝蛋白具有较好的热稳定性，使得后续提纯过程较为简便。后来他们改进方法，进一步成功在烟草和马铃薯中合成了类弹性蛛丝融合蛋白，采用实验室规模的提取方法，成功从1kg的烟草叶片中可提取到80mg的纯蛋白质，表明蛋白质表达水平得到了很大的提高[3]。

之后更多的研究结果表明，大分子蜘蛛丝蛋白的确能通过转基因植物进行相对准确的生产，并且通过转基因靶向性及融合类弹性多肽等措施能够提高蛛丝蛋白在植物中的表达水平[4]。虽然直至现在，植物载体还只能生成蛛丝蛋白分子的片段，距离生产出接近天然大小的蛛丝蛋白还有较大差距，但随着技术的不断进步，相信未来用植物作为载体生产蛛丝蛋白还会有很大的实用价值。

2.2 哺乳动物载体法

与植物相似，哺乳动物细胞也能表达大分子蛛丝蛋白，且可以显著克服重组基因在微生物载体内表达中出现的转录、翻译提前终止的问题。在山羊、奶牛、老鼠等哺乳动物细胞的基因中整合入蛛丝蛋白基因之后，其乳腺就能生产出一种蛛丝蛋白类似物。这种从蛛丝蛋白基因翻译而来的蛋白质就可以用来制造高性能的纤维材料。加拿大生物科学家发现山羊乳蛋白的生产方式与蜘蛛丝蛋白相似。通过生物工程技术，在山羊乳腺细胞中嵌入蜘蛛牵引丝基因，山羊的乳腺就能生成与蜘蛛丝蛋白相似的可溶性蛋白。运用纺丝技术，使用这种蛋白制成的新型纤维材料性能非常优秀。美国科学家通过转基因法，在奶牛的胎盘中培育“黑寡妇”蜘蛛的蛋白质基因，子代奶牛所产的牛奶中就含有蛛丝蛋白。在我国，有科学家将蜘蛛丝蛋白基因载体转入昆明白鼠受精卵的细胞核中，培育出的子代鼠便是转基因鼠，其乳腺能够产生重组蛛丝蛋白[5]。

但是，哺乳动物的基因改造与饲养成本高昂，且蛛丝蛋白在哺乳动物体内无法自然形成蛛丝纤维，后续加工繁复。因此，人们逐渐放弃哺乳动物载体法，转而开始研究家蚕生物载体法等其他方法。

2.3 家蚕载体法

与蜘蛛相似，家蚕也能产生大量高分子蛋白并进行纺丝，并且还可以大规模养殖。蛛丝蛋白与蚕丝蛋白均由富含甘氨酸和丙氨酸的串联重复序列组成，基因序列与结构也很相近。加上蚕丝历史悠久，人们对于家蚕转基因技术的研究较为深入，因此许多科学家正在致力于研究利用家蚕载体来生产蜘蛛丝。

目前将外来基因重组入家蚕DNA中的方法主要有两种：第一种是以杆状病毒作为载体来进行导入，此种方法效率较低，成功转基因后代占比低于0.2%；第二种是利用piggyBac作为载体来插入基因，效率比前者提高了大约10倍[6]。

日本、美国和我国已经有许多机构正在开发转基因家蚕载体，以期大规模生产蛛丝纤维。西南大学的文红秀等利用piggyBac载体将蜘蛛牵引丝基因导入家蚕染色体，成功分泌出含有蛛丝蛋白MaSp1的蚕丝。且该种蚕丝与原种野生型蚕丝相比，张力和弹性都更为优秀。[7]之后Tuele等也利用piggyBac转座子将一段编有78kDa蜘蛛丝蛋白的基因插入家蚕DNA中，并利用家蚕丝素重链基因启动子使外源蜘蛛丝基因在家蚕丝腺中定向表达，从而生产出复合的蚕丝/蛛丝蛋白纤维，该复合纤维的强度与天然蜘蛛牵引丝纤维相差无几，远远超过野生型蚕丝纤维的强度。[8]

2.4 微生物载体法

在生物工程的研究中，微生物表达体系（尤其是大肠杆菌）的研究已经十分深入，操作技术也已经相对成熟。大肠杆菌具有生长快、繁殖快、培育方便、结构简单等优点，是生物工程中用以表达外源蛋白质的常用宿主。1995年，Prince等开始尝试利用大肠杆菌来表达蜘蛛丝蛋白：他们根据络新妇属蜘蛛的拖牵丝蛋白序列合成相应的DNA序列，经过人工编码构建后插入大肠杆菌基因组，使其进行表达。产生的人工蛋白质含有β-折叠结构，与天然蜘蛛丝相似[9]。随后Lewis等将编码蜘蛛丝蛋白MaSp2的重复基因序列增加至8、16、32个连续的单元，通过pET载体将其转入大肠杆菌中进行表达。这种方法不但提高了蜘蛛丝蛋白表达的产量，且将表达的蛋白质分子量提高到100kDa以上。[10]之后的研究不断增加人工蛋白的分子量，已经达到接近天然蜘蛛丝的水平，用此种蛋白纺成的丝具有优良的机械性能。

但是，由于大肠杆菌和蜘蛛细胞具有不同的密码子偏好性，且基因重组时常常出现细菌部分序列删除的情况，使得蜘蛛丝蛋白的翻译有时会提前终止。而且由于大分子蜘蛛丝蛋白基因及其mRNA的结构较为复杂特殊，导致其在大肠杆菌中的转录、翻译难度较大。因此要想高效地利用微生物载体合成大分子重组蜘蛛丝蛋白，还要通过改良重组基因信息、调整细菌密码子偏好性等途径来优化外源基因的表达。

3.总结

蜘蛛丝的优秀性能在实际应用中前景广阔，越来越多的人把目光投向这种新型材料的研发与制备。目前，科学家在各个载体方面的研究都已经取得了显著的成果，但也面临许多问题。在植物、动物、微生物载体法中，人们都遇到了一个共同的难题，即如何将液态蛋白质纺织成实际使用的丝线？除生物技术外，纺织技术也将大大影响这些方法投入实际应用的成本。相较而言，家蚕载体成功的可能性更大。只要成功优化蛛丝蛋白基因，使其在家蚕丝腺中实现高效表达，将蛋白质转化为有用纤维的难题也将得以解决[11]。相信一旦蜘蛛丝成功实现量产，这种优质材料必将大规模投入生产应用，从而大大造福人类社会。

参考文献

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[2] 宁方勇，杜智恒，付晶，等.蜘蛛丝研究概况[J].黑龙江畜牧兽医，2014（15）：209-211.

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[4] Piruzian E S，Bogush V G，Sidoruk K V，et al. Construction ofsyn-thetic genes for analogs of spider silk spidroin 1 and theirexpression in tobacco plants.MolBiol，2003，37（4）：554-560.

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[8] Teule F，Miao Y G，Sohn B H，et al. Silkworms transformed withchimeric silkworm/spider silk genes spin composite silk fiberswith improved mechanical properties. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，2012，109（ 3） ： 923 C 928.

[9] Prince J T，McGrath K P，Di Girolamo C M，et al. Construction，cloning and expression of synthetic genes encoding spider draglinesilk. Biochemistry，1995，34（34）：10879-10885.

[10] Lewis R V，Hinman M，Kothakota S，et al. Expression andpurification of a spider silk protein： a new strategy for producingrepetitive proteins. Protein Expression and Purification，1996，7（4）：400-406.

[11] ㈡面茫梁梓强，梁士可，等.利用生物工程技术生产蜘蛛丝的研究进展[J].中国生物工程杂志，2016，36（5）：132-137.