枣果病原真菌的分离鉴定及特性分析
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摘要：对云南省蒙自市6个主要枣树栽培品种储藏期的腐烂果实表面的病原真菌进行分离和鉴定，得到25株优势病原真菌，分别扩增得到核糖体DNA转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）序列，通过对ITS的生物信息学和系统发育分析，并结合菌落形态特征，鉴定病原真菌分别为链格孢属（Alternaria sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、葡萄座腔菌属（Neofusicoccum sp.）和脉纹孢菌属（Neurospora sp.）。
关键词： 枣果； 采后病害； 病原真菌； rDNA-ITS； 生物信息学； 序列分析
中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）01-0070-07
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.01.020
鼠李科（Rhamnaceae）植物枣（Zizyphus jujube Mill）是中国的原产果树之一，已有数千年的栽培历史[1]。枣树在中国分布面广、适应性强、品种多、风味好，深受广大群众的喜爱，已成为中国果树发展的新热点[2]。蒙自小枣是云南蒙自较为古老的地方品种，早在明末清初已有栽培记载[3]。蒙自小枣果实近圆形，平均单果重7 g。近年来，蒙自小枣以其外观亮、皮薄、肉厚且细腻、味特甜、口感好、品质佳、早熟（较国内其他枣种早熟半个月以上）等优势热销省内外[4]，是蒙自三大果林经济作物（小枣、大枇杷、甜石榴）中单位面积产值最高者。
枣果的自然保鲜能力较差，在贮藏中果实极易感染微生物而引起腐烂变质失去商品价值，严重制约了中国红枣产业的健康发展。枣果采后病害可分为2种类型，一类是由于生理活动受到不适宜的外界条件干扰而造成的生理病害；另一类是由病原微生物引起的病理病害（侵染性病害）。据国内外文献报道，病原微生物可侵染枣叶片和枣果，枣叶片上的主要病害有枣疯病[5，6]、枣锈病[7]和枣叶斑病[8]等；枣果实主要病害有枣轮纹病[9]、枣缩果病[10]、枣黑腐病[11]、枣炭疽病[12]等。其中枣疯病、枣锈病和枣缩果病被称为枣树的三大病害。在果实储藏期，链格孢霉（Alternaria tenuis）、茎点霉（Phomaglomerata）等可引起枣果斑点性病害；镰刀菌（Fusarium oxysporum）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）可引起枣果实腐烂。因此对采摘后的枣果致病真菌进行分离和鉴定可以为科学用药提供有效的指导。
传统致病菌的鉴定主要通过形态学特征进行，受很多因素的限制。随着分子生物学技术的发展，18S rDNA基因序列在真菌的分类和鉴定系统中的应用越来越广泛[13，14]。保守的18S和28S序列有利于属的鉴定，核糖体DNA转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）则多运用于种的鉴定。对ITS序列进行生物信息学和系统发育分析，可以快速阐明菌株之间的进化关系和种群间的亲缘关系[15]。以上方法可以为快速和准确的鉴定植物真菌病害提供一定基础。
本研究以云南蒙自地区的冰糖枣、蒙自小枣、特早金脆蜜枣、胎里红枣、中华梨枣和早甜蜜甲枣等6个品种为主要研究对象，分离和纯化引起贮藏期的主要致病真菌，在传统形态鉴定的基础上，对贮藏期腐烂枣中分离到的菌株进行rDNA-ITS序列分析和分子鉴定，为不同品种枣贮藏期真菌病害防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
从云南省蒙自市文澜镇白路脚村蒙鑫大棚枣园基地采得冰糖枣、特早金脆蜜枣、胎里红枣、中华梨枣和早甜蜜甲枣5个品种的枣果，从云南省蒙自市红寨乡高家寨小枣种植园采得蒙自小枣。共采集枣果样品64份，其中高家寨枣园12份，蒙鑫大棚枣园52份，放入果品专用保鲜袋，4 ℃保存。
1.2 生化试剂
离心柱型基因组DNA提取试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；1×TAE Buffer（0.04 mol/L Tris-Cl，0.001 mol/L EDTA，pH8.0），琼脂糖（AR），0.5 mg/mL EB，DL5 000 DNA Marker，λ-Hind Ⅲdigest DNA Marker（宝生物工程（大连）有限公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京东盛创新生物科技有限公司）。
1.3 培养基
PDA培养基：取马铃薯200 g去皮切碎，加入800 mL去离子水，煮沸30 min，冷却后双层纱布过滤，取滤液，加葡萄糖20 g，定容至1 L，高压蒸汽115 ℃灭菌20 min，备用。
PDA固体培养基：在PDA培养基的基础上，加入1.5%～2%的琼脂粉。
1.4 病原菌分离纯化与菌株命名
组织分离法：用灭菌刀片分离病健处约5 mm2的果实组织块，浸泡于体积分数为75%的乙醇中30 s，然后用NaClO溶液处理1～3 min，去离子水冲洗3次，移入PDA平板上倒置于霉菌培养箱中，28 ℃培养3 d后观察菌落生长状况。
划线分离法：将分离获得的真菌菌落培养产生孢子，用接种针挑取不同形态的病原真菌的孢子或菌丝，在PDA平板上划线，培养条件同上。重复划线分离3～4次后即可纯化不同的单菌落菌株。不易纯化的菌株采取稀释平板法获得单孢纯化。
纯化所得菌种分别照样品品种名称前两个汉字的拼音首字母大写组合及菌株分离顺序依次编号命名，如冰糖枣中分离到的第4株菌命名为BT4。4 ℃保存备用。
1.5 单菌落培养与形态观察
点植法：菌落疏松易于挑取菌丝的菌株，用接种针挑起菌落边缘的少许菌丝，点植于平板PDA中央，进行平板封口后倒置于霉菌培养箱中28 ℃培养5～7 d，即可得到均匀单一的菌落。
移植法：菌落致密紧贴平板的菌株直接用打孔器从已纯化菌落上取适宜大小的菌饼接种；孢子较多的菌株用去离子水稀释的孢子悬浮液接种，置于霉菌培养箱中28 ℃培养5～7 d，即可得到均匀单一菌落。
形态学观察：培养5～7 d后，先观察单菌落的形态特征，后进行菌落插片培养，以去离子水为负载剂制片后，荧光显微镜下观察各菌株细胞形态特征。
1.6 基因组DNA的提取
28 ℃条件下，摇瓶培养各菌株收集菌丝体，去离子水冲洗培养基及杂质，滤纸吸干水分，液氮充分研磨菌丝体至粉末，装入1.5 mL离心管中，用真菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA[16]，具体步骤参照试剂盒使用说明书，后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提取基因组DNA的完整性。
1.7 基于真菌rDNA-ITS序列的分子鉴定
rDNA-ITS序列的扩增参照White等[17]的方法。以基因组DNA为模板，运用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）（南京金斯瑞生物科技有限公司）扩增致病真菌的ITS基因。
PCR扩增体系：模板DNA（0.5 μg/μL）3.0 μL，2×PCRmix（广东东胜生物科技有限公司）12.5 μL，ITS1、ITS4引物（10.0 μmol/L）各2.0 μL，加ddH2O至25.0 μL。
PCR扩增程序：94 ℃，预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。
1.8 序列比对及分子系统发育树构建
检测纯化回收PCR产物并由南京金斯瑞生物科技有限公司测序，采用ClustalW 2.0软件比对ITS基因序列，设置空位罚分为10、BLOSUM权重矩阵[18]。将各菌株ITS序列结果登陆到GenBank数据库，通过BLAST程序搜索数据库中相关高度相似序列。通过CLUSTAL_X和Mega 4.1软件采用Neighbor-Joining法构建系统进化发育树，并计算Bootstrap值，分析菌株之间在进化上的亲缘关系[19]。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离纯化
分别用PDA培养基分离纯化获得16个株菌，接种于PDA平板中央置于霉菌培养箱中28 ℃进行培养；其中，菌丝生长较快的菌株培养3 d，菌丝生长速度中等的菌株培养5～7 d，而产孢子且生长慢的菌株培养9 d，多数菌落的颜色、大小、形状、菌丝或孢子等差异较为明显，其中BT（冰糖枣）、ZH（中华梨枣）、ZT（早甜蜜甲枣）这3个品种的枣果上分离出来的4号、38号、41号、43号以及49号病原真菌培养于PDA平板上28 ℃可以产生孢子。各样品分离纯化的菌株的编号、培养周期及其产孢结果见表1。
2.2 菌株的形态学观察
所分离的16个菌株在28 ℃条件下PDA培养基上进行单菌落培养，根据其生长速度快慢分别培养3、5～7 d和9 d后观察菌落形态；其间，于单菌落长出后在其边缘进行插片，菌丝爬片或产孢后进行镜检。菌落形态观察包括菌落正反面颜色、菌落边缘形状、菌落表面布纹、菌落高度、菌落大小、菌落质地以及菌丝长短、粗细、有无横膈及核、分枝、分生孢子梗、分生孢子形态和产孢结构等[20，21]（图1）。所分离菌株的单菌落形态、菌丝和孢子的显微特征（图2），各菌株的菌落形态、菌丝和孢子的显微特征描述见表2。
2.3 致病菌株基因组DNA和ITS基因序列分析
本试验获得的致病霉菌基因组DN段经DNA电泳检测，结果显示，多数菌株基因组DNA分子量大约为10～20 kb（图3A），多数菌株ITS基因大小在500～750 bp之间（图3B），而菌株TJ29、TL35、TL36和ZT46的ITS基因大小在250～500 bp之间，菌株ZH38、ZT45和ZT49的ITS基因大小在750～ 1 000 bp之间。测序结果显示各菌株ITS基因长度为316～928 bp，约56%的菌株ITS序列长度在500～750 bp之间，25%的菌株ITS序列长度在250～500 bp之间，约19%的菌株ITS序列长度在750～1 000 bp之间，与电泳检测结果基本一致，所有菌株的ITS序列平均长度约为568 bp，各菌株的ITS序列长度统计见表3。
2.4 菌株的分子鉴定结果与ITS序列系统进化分析
根据BLAST比对结果，结合菌株的形态学特征，利用生物学软件MEGA4.0构建系统发育树。鉴定结果表明，ZH43和ZT49属于曲霉属；ZH38位于曲霉属菌株邻近的单独分枝上，分枝结点的支持系数为100，亲缘关系较近，认为其可能为曲霉属的潜在新种或变种（图4）。BT4、MZ12、TJ29、TL37、ZH41、ZT44、ZT45链格孢属；TJ26、TJ27位于链格孢属菌株邻近的单独分枝的两个侧枝上，其分枝结点为63，认为其可能为链格孢属的两个不同的潜在新种或变种（图5）。TL35、TL36和ZT50属于葡萄座腔菌属；ZT46属于脉纹孢菌属（图6）。
3 小结与讨论
枣果储存期病原真菌的传统鉴定一般根据分生孢子形态、大小、分生孢子梗及菌落形态等形态学特征，结合其生理生化性状作相关的描述。但是，有一些霉菌的形态学特征又因环境的差异而变化，不少霉菌培养性状的可变性及形态特征的交叉，必然导致霉菌的分类标准不可靠。故采用传统的形态学鉴定霉菌会产生一定的分歧，存在着一定的弊端。随着分子生物学技术的快速发展，ITS分子标记已被广泛应用于霉菌的属内不同种间或近似属间的系统发育研究，为真菌的系统发育和分类鉴定提供丰富的遗传信息。本研究中，在菌种保存过程中发现，继代会造成菌株形态上不同程度的不稳定性，以TJ29、ZH38和ZT45最为明显；并且在菌株培养和菌种保存过程中，多数菌株不产孢，依靠序列分析对16个菌株进行了鉴定、分类，提高了鉴定的可靠性和准确性。
国内郑晓莲等[22]、徐祥彬等[23]、李冬霞[24]研究认为，链格孢菌、橄榄色盾壳霉菌（Coniaothyrium olivaceum Bon）、聚生壳菌（Dothriorella gregaria Sacc）、青霉菌（Penicillium expansum）、芽枝孢菌（Cladosporium tenuissimum）、七叶树壳梭孢（Fusicoccum aesculi Corda）和茎点霉菌（Phoma sp.）是枣缩果病的病原真菌；王军等[25]、李夏鸣等[26]研究认为，引起枣果黑斑的病原为链格孢菌；刘春琴等[27]人研究认为，囊孢壳菌（Physalosoora obtuse）、茎点霉菌和细链格孢菌是金丝小枣浆烂果病的致病菌。据国外文献报道，在果实储藏期，链格孢属、茎点菌、玉米新月弯孢霉（Curvularia lunat）、多主枝孢霉（Cladosporium herbarum）可引起枣果斑点性病害；镰刀菌、黑附球菌可引起枣果实腐烂[28]。本研究结果显示链格孢属9株，为优势菌群，与上述报道一致。3株为葡萄座腔菌属（Botryosphaeria），该病原菌赵晓军等[29]认为是枣树干腐病病原菌的致病真菌的无性阶段。而本研究鉴定分离出来的曲霉属及脉纹孢菌属在国内未见报道，另一枣果病原优势真菌群茎点霉菌在本研究中未发现。这可能是由于真菌鉴定时采用的方法不同所致，也可能与采样在不同的年份、不同的栽培地、病虫害防治和管理手段的差异等有关，其不同的生态环境造成枣果表面分布不同的霉菌。本研究的样品材料来自蒙自地区两个规模较大的枣果生产基地，取材范围较为狭窄，还应扩大筛选范围，同时进行多年取样研究，从而进一步验证以上结论。此外，本研究中所分离的引起枣果腐烂的霉菌来自两组样标，一组为采集时已腐烂的枣果，另一组为健康枣果，后者采样后于4 ℃冰箱中贮存腐烂后无菌条件下进行组织分离菌种，根据分离纯化结果初步确定这些菌株与枣果的腐烂有关，而进一步确认其是否均为枣果腐烂的直接病原菌，还需于次年采集相应品种的健康枣果做回接试验进行后续研究进一步确定。
本研究从云南蒙自地区的6个不同品种的枣果中分离得到16株致病霉菌，经形态学特征观察和ITS序列分析鉴定其隶属链格孢属、曲霉属、葡萄座腔菌属和脉纹孢菌属4个菌属；其中链格孢属9株，曲霉属3株，葡萄座腔菌属3株，脉纹孢菌属1株。采用ITS序列分析结合形态学特征观察可准确、快速鉴定引起枣果腐烂的病原真菌，且结果可靠，可为枣果采收期或贮藏期腐烂霉菌的综合防治研究提供一定的理论支持，同时还可为引起其他果蔬采收期或贮藏期的真菌性病原菌鉴定提供一定的参考。
从国内外的研究报道可知，由病原微生物引起的枣果实病害枣缩果病和枣黑斑病的主要病原真菌为链格孢属病原菌，该病原菌属于半知菌亚门丝孢纲丛梗孢目黑色菌科，是农作物的主要致病菌之一。全世界已报道的近500个链格孢属病原真菌95%以上可兼性寄生于植物引起作物病害[30]，其代谢产物可导致受害植物产生诸如黑斑病、褐斑病、茎枯病等症状，对作物的产量和品质产生严重影响，从而造成巨大的经济损失。化学防治是防治由链格孢属真菌引起的农作物疫病的有效手段[31]。目前防治这些疫病的化学药剂主要有代森锰锌、异菌脲、三唑酮、嘧菌酯、腐霉利等[32]。但是由于这些药剂的长期使用使得部分地区的链格孢属真菌已经对一些杀菌剂产生了一定的抗药性。目前国内外对链格孢属的抗药性的报道主要集中在农作物上，引起枣缩果病和枣黑斑病的链格孢属真菌的抗药性筛选及作用机理在国内外还鲜有报道。
参考文献：
[1] 曲泽洲，王永蕙.中国果树志・枣卷[M].北京：中国林业出版社，1993.
[2] 周禹含，毕金峰，陈芹芹，等.中国红枣加工及产业发展现状[J].食品与机械，2013，29（4）：214-217.
[3] 吴杏红.蒙自小圆枣丰产优质栽培技术[J].柑桔与亚热带果树信息，2004，20（4）：37-38.
[4] 何 英，李春燕，黄素芳.蒙自小枣与金丝小枣的对比研究[J].红河学院学报，2004，2（6）：20-23.
[5] 肖 京，杨艳荣，赵 锦，等.骏枣不同株系间的枣疯病抗性多样性[J].中国农业科学，2013，46（23）：4977-4984.
[6] 陈作义，沈菊英，龚祖埙，等.枣疯病病原体的电子显微镜研究―Ⅱ.类菌质体[J].科学通报，1978（12）：751，755.
[7] 孙其宝，俞飞飞，陆丽娟，等.枣锈病菌的室内抑菌试验及杀菌剂筛选[J].安徽林业科技，2011，37（2）：30-33.
[8] 邵立平.真菌分类学[M].北京：中国林业出版社，1984.
[9] 常聚普.枣轮纹病发病规律及综合防治技术[J].中国果树，2004（4）：29-30.
[10] 张朝红，刘孟军，周俊义，等.枣缩果病研究进展[J]河北林果研究，2008，23（1）：62-81.
[11] 曲俭绪，沈瑞祥，李志清，等.枣黑腐病病原研究[J].森林病虫通讯，1992（2）：1-4.
[12] 孙永安，师宗舜，王煨时.大枣炭疽病的研究[J].中国果树，1984（2）：40-44，50.
[13] 刘春来，文景芝，杨明秀，等.rDNA-ITS在植物病原真菌分子检测中的应用[J].东北农业大学学报，2007（38）：101-106.
[14] IWEN P C，HINRICHS S H，RUPP M E，et al. Utilization of the internal transcribed spacer regions as molecular targets to detect and identify human fungal pathogens[J]. Med Mycol，2002，40：87-109.
[15] ZHANG H Y，ZHENG X D，YU T，et al. Biological control of postharvest diseases of peach with cryptococcuslaurentii[J].Food Control，2007，18（4）：287-291.
[16] 孙立夫，张艳华，裴克全.一种高效提取真菌总DNA的方法[J].菌物学报，2009，28（2）：299-302.
[17] WHITE T J，BRUNS T D，LEE S B，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phytogenctics. In： Innis MA etal. eds. PCR protocols[J].San Diego：Academic Press，1990，9：315-322.
[18] THOMPSON J D，HIGGINS D G，GIBSON T J. CLUSTAL W： Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting， position-specific gap penalties and weight matrix choice[J]. Nucleic Acids Research，1994，22：4673-4680.
[19] 王禄山，高培基.生物信息学应用技术[M].北京：化学工业出版社，2008.
[20] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.
[21] 韩燕峰.中国拟青霉属的系统学及部分菌株的致病性研究[D].贵阳：贵州大学，2007.
[22] 郑晓莲，齐秋锁，赵光耀，等.枣缩果病病原子实体的诱导与鉴定[J].植物保护，1996，22（6）：6-8.
[23] 徐祥彬，赖童飞，景云飞，等.山西壶瓶枣缩果病病原茵分离和鉴定[J].植物病理学报，2009，39（3）：225-230.
[24] 李冬霞.枣缩果病病原菌的分离鉴定及枣树内生真菌多样性分析[D].郑州：河南农业大学，2010.
[25] 王 军，辛玉成.冬枣黑斑病病原的分离与鉴定[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2007，24（1）：21-23.
[26] 李夏鸣，郭黄萍，胡增丽，等.枣黑斑病研究[J].山西农业科学，2009，37（11）：37-40.
[27] 刘春琴，王庆雷，张立震，等.金丝小枣浆烂果病症状、危害及病菌鉴定[J].中国农业大学学报，2004，9（2）：31-35.
[28] MORTON J F. Frutis of Warm Climates[M].Miami，Florida：Julia F Morton，1987.
[29] 赵晓军，周建波，赵子俊，等.枣树干腐病病原菌的鉴定[J].菌物学报，2009，28（3）：332-335.
[30] M？RQUEZ L M，REDMAN R S，RODRIGUEZ R J， et al. Avirus in a fungus in a plant：Three-way symbiosis required for thermal tolerance[J].Science，2007，315（5811）：513-517.
[31] HIRAM S，ROBERT K B. A review of Alternaria alternata sensitivity[J].Rev IberoamMicol，2001，18：56-59.
[32] 崔 迪，王继华，陈 捷，等.链格孢属真菌对农作物的危害[J].哈尔滨师范大学自然科学学报，2005，21（4）：87-91.