热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清基质金属蛋白酶―3的影响
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【摘 要】目的：观察热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清基质金属蛋白酶-3的影响，初步揭示热痹康汤治疗类风湿关节炎的作用机理。方法：采用牛Ⅱ型胶原蛋白和弗氏不完全佐剂诱导胶原诱导性关节炎大鼠模型，以甲氨蝶呤为对照，观察热痹康汤对各组大鼠血清基质金属蛋白酶-3水平的影响。结果：热痹康汤能降低胶原诱导性关节炎大鼠血清基质金属蛋白酶-3的水平，作用优于甲氨蝶呤（P < 0.05）。结论：热痹康汤能下调胶原诱导性关节炎大鼠血清基质金属蛋白酶-3的水平，这是其治疗类风湿关节炎的作用机理之一。
【关键词】 热痹康汤；关节炎，胶原诱导性；基质金属蛋白酶-3；实验研究；动物；大鼠
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因尚不明确的主要累及关节，以慢性、对称性多关节炎为突出临床表现的全身性自身免疫疾病。活动期的RA患者血清中基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）水平明显升高，提示MMP-3在RA的发病中起着重要的作用。本实验采用牛Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）和弗氏不完全佐剂诱导胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，观察热痹康汤对大鼠血清MMP-3的影响，探讨热痹康汤治疗RA的作用机理。
1 实验材料
1.1 实验动物 雌性Wistar大鼠50只，体重（100±10） g，购于广西中医药大学实验动物中心。
1.2 实验试剂 弗氏不完全佐剂、牛Ⅱ型胶原蛋白（由美国Chondrex公司生产）；MMP-3检测试剂盒（由南京建成生物工程研究所生产）。
1.3 实验药品 热痹康汤（由广西中医药大学附属瑞康医院新药研发中心制备提供），药物组成：秦艽15 g、防风10 g、桂枝10 g、威灵仙10 g、制川乌10 g、地龙10 g、桑枝15 g、葛根15 g、忍冬藤15 g、青风藤15 g、黄柏20 g、苍术15 g；甲氨蝶呤片【由上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产，生产批号20070121】。
2 方 法
2.1 动物造模及分组 50只Wistar大鼠适应性喂养7天后，造模方法参照文献[1]方法进行：在无菌条件下，用0.1 mol・L-1冰醋酸充分溶解牛II型胶原蛋白（浓度为4 mg・L-1），置冰箱4 ℃过夜后，再与等体积弗氏不完全佐剂（1 mg・mL-1）混合、震荡至充分乳化，制成CⅡ乳剂，置冰箱4 ℃保存备用。实验时于每只大鼠颈、背部多点皮内注射CⅡ乳剂0.25 ml，14天后再次注射（方法和剂量同上）。造模成功后（评分4分以上）随机分为模型组、甲氨蝶呤组、热痹康汤高剂量组、热痹康汤中剂量组、热痹康汤低剂量组共5组，每组10只。
2.2 给 药 模型组给予生理盐水2 ml・（100 g）-1灌服，每天1次；甲氨蝶呤组予灌服甲氨蝶呤药液2.7 mg・kg-1，每只约0.405 mg，每周1次；热痹康汤各剂量组，分别灌服热痹康汤（含生药16 g・kg-1、
8 g・kg-1、4 g・kg-1）2 ml・（100g）-1，每天2次。共治疗28天。
2.3 项目检测
2.3.1 关节肿胀评分 参照有关文献[2]采用0～4级关节评分法。0分：无关节炎；1分：小趾关节轻度肿胀；2分：小趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内全部关节肿胀；关节指数积分越高，关节症状越严重。评分4分以上为造模成功。
2.3.2 MMP-3检测 治疗结束后，腹腔注射水合氯醛将各组大鼠麻醉，腹主股动脉抽血，分离血清并放置冰箱-20 ℃保存备测。MMP-3的测定采用ELISA试剂盒，并按试剂盒说明进行检测。
2.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行数据分析，所有数据以表示，不同组间用方差分析及t检验。
3 结 果
治疗28天后热痹康汤各剂量组MMP-3水平均有降低，与模型组相比，差异有统计学意义
（P < 0.05）；热痹康汤高、中剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。
4 讨 论
RA是一种系统性、全身性的免疫性疾病。其基本病理改变是滑膜炎，出现滑膜炎症、增厚、血管翳形成、软骨及软骨下骨质破坏，最终导致关节畸形。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一组在结构上具有极大同源性，能降解几乎所有细胞外基质成分的酶，主要参与组织重建与修复、炎症反应、伤口愈合、软骨基质的降解和骨吸收等，在关节炎等病理状态下，使基质发生不可逆的降解以及关节内炎症反应逐步加重，MMPs的异常表达可促进RA的发生和发展。
MMP-3是金属蛋白酶类的主要成员之一，是导致软骨降解最重要的蛋白酶，它在滑膜、软骨和软骨下骨的细胞外间质的降解中有着重要的作用，影响软骨的降解，使软骨基质崩解，从而导致软骨的破坏[3]。MMP-3能激活胶原蛋白酶、间质胶原酶及进一步的酶链反应，作用于软骨引起骨组织的破坏。同时，炎性浸润的滑膜细胞滑膜绒毛样生长形成血管翳；血管翳沿软骨表面逐渐侵入与软骨紧密黏连形成软骨-血管翳，促使软骨变性和进一步破坏[4]。国外有研究表明，在早期的RA患者中，外周血清MMP-3水平较正常人明显升高，并且与ESR、CRP、放射学评分、关节功能评定呈正相关[5，6]。
MMP-3在RA关节破坏中发挥着极其重要的作用，它是RA早期疾病活动的一个重要预测因子和炎症标志物，可作为反映病情活动指标以及滑膜损害和预后的预测指标。
热痹康汤是庞学丰教授治疗类风湿关节炎的经验方，具有清热利湿、除痹止痛之功效。我们用热痹康胶囊治疗湿热型RA患者发现，该药能明显降低患者的C-反应蛋白、类风湿因子、血沉、免疫球蛋白等实验室检测指标，能明显改善患者的临床症状以及关节功能，无明显毒副作用[7]。动物实验表明，热痹康汤能降低CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的水平，升高IL-4的水平[8，9]。本研究结果表明，热痹康汤能降低CIA大鼠血清MMP-3的水平，能减轻关节滑膜的炎症，是其治疗类风湿关节炎的作用机理之一。
5 参考文献
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