农杆菌介导phyA基因转化玉米愈伤组织培养体系的优化
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摘要：以根癌农杆菌（Agrobacterium）EHA105介导外源基因phya转入玉米（Zea mays L.）自交系GS01的胚性愈伤组织， 并利用除草剂（草胺磷）筛选出抗性愈伤组织，培养并获得再生植株。结果表明，菌液浓度及侵染时间显著影响愈伤组织的转化率;不同激素种类及配比对抗性愈伤组织再生植株的影响明显。当菌液浓度OD600 nm为0.6，侵染时间为20 min时，抗性愈伤组织的转化率最高，达到了68.7%，为玉米农杆菌转化并获得再生植株奠定了基础。
关键词：农杆菌（Agrobacterium）;玉米（Zea mays L.）自交系;遗传转化;phyA基因
中图分类号：S513.032 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）02-0465-03
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.02.054
Optimizing Conditions of Transforming phyA Gene into Maize with Agrobacterium
XU Dan-dana，WANG Pi-wub，ZHAO Han-dana，LIU Shuanga，CHENG Zhao-tinga，GUAN Shu-yana
（a.College of Life Sciences;b. College of Agronomy，Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）
Abstract： Foreign gene phyA was transfered to embryonic callus of maize inbred lines GS01 with Agrobacterium EHA105-mediated. Herbicides （alachlor P） were used to screen resistant callus and regenerate plantlets. The results showed that bacteria concentration and infection time affected callus conversion rate significantly. Types of hormone and proportion affected obviously regeneration plantlet of resistant callus. Bacteria concentration was 0.6 at OD600 nm. Infection time was 20 min. Resistant callus rate was high with 68.7%. It will provide a good reference for the regeneration and transformation of maize mediated by Agrobacterium.
Key words： Agrobacterium; maize inbred lines; genetic transformation; phyA gene
玉米（Zea mays L.）是粮食作物中重要的工业原料，在全世界粮食生产中占有举足轻重的地位[1-3]。2010年，我国玉米种植面积达到了324万hm2，成为世界第二大玉米生产国，而玉米也成为了我国的“谷物之王”[4]。玉米在我国经济生产中占有重要地位，因此大力提高玉米的产量及品质，成为了众多学者积极探寻的问题[5-7]。植酸酶能有效地水解食物以及土壤中植酸态有机磷，释放出生命体可以直接吸收利用的无机磷酸及其铁、钙、锌、镁等盐类，有效地提高了其生物利用率。因此，植酸酶基因克隆及导入受体组织并获得可再生植株对研制植酸酶食品或饲料添加剂、开发高级保健食品和优质饲料、循环利用土壤中有机磷、缓解全球性磷矿产资源危机等具有重要意义[8-13]。本研究以玉米自交系GS01的胚性愈伤组织为材料，将连有根部特异性启动子和植酸酶基因phyA的载体转入玉米自交系中，对影响农杆菌介导的玉米遗传转化的因素进行探讨，从而确定了农杆菌介导转化的最佳菌液浓度及最佳侵染时间，优化了农杆菌介导玉米遗传转化条件，并成功获得玉米抗性苗，为基因工程育种打下了基础，为获得含有phyA基因的转基因玉米植株提供了条件，同时为进一步提高玉米的产量及品质的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 外植体 采用玉米自交系GS01的胚性愈伤组织作为遗传转化的受体进行转化，由吉林农业大学生物技术中心实验室提供。
1.1.2 菌种 含有phyA基因和玉米根部特异启动子基因构建的重组质粒pCAMBIA3301-ZmGLU1P-PhyA-Nos的根癌农杆菌EHA105，由吉林农业大学生物技术中心实验室保存并提供。
1.1.3 培养基 本试验所用的培养基见表1。
1.2 方法
1.2.1 抗性愈伤筛选标记的确定 本研究所构建的表达载体为Bar基因的筛选标记，筛选培养采用除草剂筛选的方法，即用草胺磷进行筛选。
1.2.2 农杆菌介导转化玉米愈伤组织
1）农杆菌菌液的制备。将带有质粒pCAMBIA3301-ZmGLU1P-PhyA-Nos单菌落，接种于含5 mL卡那霉素的5 mL YEP液体培养基中，于27 ℃、200 r/min培养过夜，再转入50 mL YEP液体培养基中，培养至对数生长期（OD600 nm在0.5～0.6）时，收集菌体，重悬于MS液体培养基中待用。
2）玉米愈伤组织的诱导。取授粉12～16 d的玉米自交系GS01的幼穗，先用75%乙醇消毒8～10 min，再用0.5%次氯酸钠浸泡消毒12～15 min，无菌水洗2～5次后，在无菌条件下取幼胚接种于诱导培养基上，26 ℃暗培养3～4周，产生Ⅰ型愈伤组织，每隔2～3周继代1次，诱导出Ⅱ型胚性愈伤组织，作为农杆菌转化的受体材料。
3）农杆菌转化玉米愈伤组织。将含有质粒pCA
MBIA3301-ZmGLU1P-PhyA-Nos的农杆菌EAH105的单菌落，接种于LB液体培养基（含有50 mg/L 卡那霉素）中，27 ℃、180 r/min振荡培养至对数生长期（OD600 nm达到不同值），收集菌体，用同体积侵染培养基重悬菌体，用此菌液在三角瓶中侵染胚性愈伤组织15～25 min，每隔5 min振荡1次，然后收集菌体，倒掉菌液，将愈伤组织放入铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干愈伤组织表面多余的菌液，然后转入共体培养基中（附加200 μg/L AS）中27 ℃暗培养3 d左右。
4）愈伤组织的筛选、分化及植株再生。将愈伤组织移入筛选培养基中（含一定浓度的除草剂），筛选生长旺盛的新鲜的抗性愈伤继代3次（每15～20 d左右继代1次），抗性愈伤转至分化培养基中，分化出苗，再转入生根培养基生根。再移栽到培养室盆栽，最后移栽到大田，进行田间栽培。
2 结果与分析
2.1 不同菌液浓度对玉米抗性愈伤组织转化率的影响
农杆菌的生长时期不同，侵染能力有很大差别，农杆菌浓度过高或过低都会影响其转化率，本研究分别取OD600 nm为0.5、0.6和0.7用于转化玉米GS01愈伤组织。结果表明，农杆菌生长到对数中期时OD600 nm为0.6时具有最高的转化率，在这个时期农杆菌感染能力最强（表2）。
2.2 不同侵染时间对玉米抗性愈伤组织转化率的影响
利用农杆菌侵染不同玉米愈伤组织时，侵染时间的长短对其转化率也有重要的影响。侵染时间过短，农杆菌不能充分吸附在外植体上，从而降低了抗性愈伤组织转化率;相反，若农杆菌侵染时间过长，由于农杆菌大量繁殖而造成抑菌困难则会使外植体褐化死亡，二者都会降低抗性愈伤组织转化率。因此，对侵染时间进行研究，确定最佳的侵染时间是十分必要的。本研究设定农杆菌侵染时间分别为15、20和25 min。结果表明，侵染时间为20 min时具有最高的抗性愈伤组织转化率（表2）。
2.3 不同激素对玉米抗性愈伤组织分化及再生的影响
在A、B、C、D培养基中分别添加了不同浓度的6-BA、IBA和KT，研究不同激素单独及配合使用对玉米幼胚愈伤组织的诱导效果（表3）。由表3可看出，A、B、C和D 4种培养基对玉米幼胚愈伤组织的分化效果不同，其中B、C培养基上的分化率分别为17.6%和15.4%，再生率为9.6%和9.1%，即分化培养时，相同条件下，2.0 mg/L的6-BA比1.0 mg/L的KT效果好;A、D两种培养基上的分化率和再生率分别为20.5%、19.4%和18.6%、14.5%，A培养基上的分化与再生效果要好于D培养基，即0.8 mg/L IBA与1.5 mg/L 6-BA配合使用对玉米抗性愈伤的分化和再生效果要好于加入1.0 mg/L KT和1.0 mg/L 6-BA的培养基;而A、D两培养基上的分化率和再生率均高于B、C两种培养基，说明不同种类和浓度的激素配合使用对抗性愈伤组织分化和再生的效果更好。
3 小结与讨论
本试验利用农杆菌介导法将phyA基因导入玉米自交系GS01的胚性愈伤组织中，通过Bar基因的筛选标记，使用除草剂进行抗性愈伤的筛选，并优化了农杆菌介导的玉米愈伤组织遗传转化条件。结果表明，①当菌液浓度OD600 nm为0.6时，抗性愈伤组织转化率最高;②侵染时间20 min为愈伤组织的适宜侵染时间;③不同浓度的激素搭配使用有利于抗性愈伤组织的分化和再生。
农杆菌介导法转化玉米愈伤组织除了受基因型、愈伤组织状态及菌种种类等因素影响外，农杆菌菌液的浓度、侵染愈伤组织时间和添加不同的激素也会对其产生重要的影响。如果农杆菌菌液浓度过低，那么就会导致农杆菌附着于外植体伤口处的浓度低，以至于不能进行充分转化;而菌液浓度过高，那么农杆菌生长已处于对数生长后期，侵染能力会下降，易导致在共培养时农杆菌的过度增长，加大了对愈伤组织的损害，导致了外植体的褐化死亡。如果侵染时间过短，只有很少的农杆菌吸附在外植体上，导致T-DNA不能有效转移或转化的细胞不够多，从而降低了抗性愈伤组织转化率;相反，若农杆菌侵染时间过长，农杆菌会过度繁殖，最终导致农杆菌的污染或因农杆菌毒性过强而使外植体褐化死亡，二者都可以降低抗性愈伤组织转化率[14-16]。培养基中添加不同种类和浓度的激素对抗性愈伤组织的分化与也起着重要的作用，在本试验设定条件下，6-BA对抗性愈伤组织分化及再生的效果比KT好，不同种类和浓度的激素配合使用对抗性愈伤组织分化和再生的效果好。
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