八角茴香油对变形链球菌细菌生物膜的影响
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摘要：目的 探讨不同浓度的八角茴香油对变形链球菌抗菌效果及对其生物膜形成的抑制能力。方法 ①通过抑菌实验和杀菌实验测定八角茴香油对变形链球菌的最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）；②配制不同浓度的八角茴香油（1.25%、2.5%、5%、10%），作用于培养24h形成成熟生物膜的变形链球菌，利用AO/EB荧光染料染色，在激光共聚焦显微镜扫描生物膜并分析活菌与死菌比例。结果 八角茴香油对变形链球菌有良好的抑制作用，MIC为5%，MBC为10%。不同浓度的八角茴香油对变形链球菌生物膜的形成均有一定破坏作用，5.0%、10%浓度八角茴香油对变形链球菌生物膜破坏最大，活菌与死菌比例分别为（0.192±0.011）、（0.062±0.004）。结论 八角茴香油能够有效的抑制并杀灭变形链球菌，而且能抑制其生物膜的形成。
八角茴香（IlliciumverumHook.f.）简称八角，俗称大茴香、大料[1]，木兰科八角属。八角茴香油（StarAniseOil）提取自八角茴香的果实或枝叶。其在医学上有广泛的作用，如良好的抗氧化[2]、抑菌[3]、杀虫[4]、镇痛[5]和升高白细胞[6]的作用，且毒性作用小、副作用少。细菌生物膜（bacterialbiofilm）是细菌为适应环境生长而附着在材料表面形成的一种群落，与浮游生物明显不同的是它能增加微生物对抗生素的抵抗能力，还可诱导耐药机制的产生。
目前国内对于八角茴香油的抑菌研究主要集中在杀菌，抑菌实验，但对生物膜的抑制作用的相关研究甚少。本研究主要通过在体外复制变形链球菌生物膜模型，利用激光共聚焦显微镜观察八角茴香油对生物膜的作用，期望为临床用药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1材料与仪器 ①八角茴香油购买于广州晶晶生物科技有限公司；②变形链球菌标准株ATCC25175购买于中国微生物菌种保藏中心；③培养基为普通营养琼脂培养基和肉汤培养基，购买于青岛日水生物科技有限公司；④激光共聚焦显微镜（Olympus），高压蒸汽灭菌器（SANYO），恒温培养箱（上海申贤恒温设备厂），振荡摇床（江苏太仓市实验设备厂THZ-D）。
1.2方法
1.2.1菌悬液的制备 菌种活化培养后，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并用10倍稀释法将菌液稀释计数，配置菌悬液浓度分别为107cfu/ml、1×105cfu/ml，标准菌悬液现配现用。
1.2.2八角茴香油MIC的测定 采用试管二倍稀释法，测定八角茴香油抑制变形链球菌生长的最小抑菌浓度。八角茴香油倍减梯度浓度系列为30%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%，共6个浓度试管，充分震荡混匀，使各管中含菌量为106cfu/ml，分别设生理盐水阴性对照以及相应浓度的酒精对照。37℃培养24h后，从各管肉汤中取出培养液0.1ml，分别涂布平板，培养24h后，观察有无细菌生长，有为阳性，无为阴性，以无细菌生长的最小药物浓度为MIC。
1.2.3八角茴香油MBC的测定 将MIC实验各管稀释2倍后继续37℃培养24h后，从各管肉汤中取出培养液0.1ml，分别涂布平板，培养24h后，观察有无细菌生长，有为阳性，无为阴性，以无细菌生长的最小药物浓度为MBC。
1.2.4八角茴香油对变形链球菌生物膜形成的影响 6孔板中浸入经浓硫酸和75%酒精处理的灭菌盖玻片，每孔加入0.2ml菌悬液（1×105cfu/ml）和4.8ml培养液，37℃条件下培养24h，每12h更换培养液。弃掉培养液，加入相应浓度的八角茴香油5ml，以生理盐水和5%乙醇作为对照组。37℃条件下培养24h，将染液AO/EB按1∶1混合均匀，取300ul混合染液加入各孔内，室温避光染色15min，用PBS缓冲液彻底清洗掉残余染料，激光共聚焦观察生物膜形态变化，波长488nm/543nm，并记录其平均荧光强度。
2 结果
2.1八角茴香油的MIC和MBC 八角茴香油的MIC和MBC分别为5%和10%，而酒精对照组并不能有效的抑制变形链球菌的生长，说明八角茴香油能有效抑制变形链球菌的生长。
2.2八角精油对成熟菌体生物膜抑制作用 激光共聚焦显微镜下可见生物膜中死菌在相应的激光激发条件下呈红色，活菌呈绿色。由图1和表1观察可得：空白组的生物膜形成最好，大量的变形链球菌聚集成片；当精油浓度较低时，细菌生物膜依然较完整，但是死菌比例（红色荧光强度）明显升高，平均荧光强度（活菌/死菌）降至（0.653±0.017）及（0.712±0.042）；随着精油浓度的升高（5%时），大量的细菌自生物膜脱落，细菌密度显著降低，仅剩少量细菌粘附在玻片上；经10%精油作用后，生物膜基本消失，只剩少量死菌粘附。
3 讨论
本文主要研究了八角茴香油对变形链球菌的抑菌能力及对其生物膜的抑制和清除作用。实验结果表明，八角茴香油对变形链球菌的最小抑菌浓度（MIC）为5%，当浓度达到10%时，可有效的杀灭变形链球菌。由八角茴香油抑制变形链球菌生物膜的结果显示，低浓度（1.25%、2.5%）的八角茴香油就可杀灭生物膜上的细菌，但生物膜依然较完整；当浓度更高（5.0%、10.0%）时，可有效的抑制并清除已经形成的生物膜。以上实验均表明了八角茴香油能够有效的抑制并杀灭变形链球菌，而且可以抑制并清除变形链球菌的生物膜。八角茴香油是日常生活的常用调味料，方便易得，成本低，天然无毒，因此具有潜在的应用前景。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2010：361.
[2]付敏东，李成欢.八角茴香油的提取工艺及抗菌、抗氧化性作用[J].中国医药导报，2011，08（34）：29-31.
[3]梅林，赖容.八角茴香抑菌活性试验研究[J].激光杂志，2010，31（3）：97-97.
[4]赵鸿峥，骆骄阳，刘秋桃，等.药用植物挥发油驱蚊作用的研究进展[J].中国中药杂志，2016（1）.
[5]黄丽贞，杨玲玲，邓家刚，等.八角茴香水提物对实寒证大鼠的影响[J].世界科学技术：中医药现代化，2015（5）：971-975.
[6]连锦花，孙果宋.八角的研究进展[J].化工技术与开发，2010，39（3）：31-33.编辑/倪冰冰