热预处理对小鼠创伤性脑损伤的神经保护作用
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[摘要] 目的 观察热预处理（HA）对小鼠创伤性脑损伤（TBI）的神经保护作用。 方法 60只小鼠分为正常对照（NT）组、HA组、TBI组、HA+TBI组，每组15只，采用改良自由落体损伤装置建立小鼠TBI模型。观察和比较各组小鼠的麻醉苏醒时间、苏醒后的一般行为学表现、脑组织含水量，脑切片苏木精-伊红（HE）染色观察病理学改变，FJB染色观察神经元变性情况。 结果 与TBI组比较，HA+TBI组的麻醉苏醒时间缩短，脑组织含水量降低，脑组织染色显示病理损伤程度减轻，变性神经元减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。HA+TBI组的麻醉苏醒时间长于NT组与HA组，脑组织含水量高于NT组与HA组，差异有统计学意义（P < 0.05）。NT组与HA组的麻醉苏醒时间和脑组织含水量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 闭合性脑损伤模型构建成功，HA对闭合性脑外伤具有神经保护作用。
[关键词] 热预处理；创伤性脑损伤；神经保护作用
[中图分类号] R651 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（a）-0020-04
[Abstract] Objective To investigate the neuroprotective effects of heat preconditioning （HA） on mice with traumatic brain injury （TBI）. Methods 60 mice were divided into normal control （NT） group， HA group， TBI group and HA+TBI group， each group of 15 mice. Free fall injury improved device was adopted to establish the mice model of TBI. The anesthesia recovery time， general behavior， brain tissue water content of mice in each group were compared and observed. Pathological change was observed by using HE staining， neuronal degeneration was observed by using FJB staining. Results Compared with TBI group， the anesthesia recovery time of HA+TBI group was shorter， brain tissue water content of HA+TBI group was lower， pathological damage of brain tissue in HA+TBI group was reduced， neuro degeneration of HA+TBI group was decreased， the difference was statistical significance （P < 0.05）. The anesthesia recovery time of HA+TBI group was longer than that of NT group and HA group respectively， brain tissue water content of HA+TBI group was higher than that of NT group and HA group respectively， the difference was statistical significance （P < 0.05）. The anesthesia recovery time and brain tissue water content of NT group and HA group were compared， with no statistical difference （P > 0.05）. Conclusion Closed TBI mice model has established successfully， and HA can offer neuroprotective effects on closed TBI.
[Key words] Heat preconditioning； Traumatic brain injury； Neuroprotective effect
创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是慢性致残和致死的主要原因之一，也是我国儿童和青年的主要致残、致死原因。脑外伤后，局部组织发生继发性的缺血缺氧性损伤，导致神经细胞出现不可逆的损伤，另外，机械性损伤可直接损伤脑细胞，使神经元发生直接死亡或促进程序性死亡，这两种损伤方式都可导致患者出现各种神经后遗症。因此，对神经损伤的防治是抢救TBI的重要环节之一，应对热预处理（HA）的保护效应进行探讨。有研究显示，机体在HA后可产生保护效应，通过交叉耐受机制，对多种应激源具有保护作用[1-2]。HA的保护效应是近年来国内外相关研究的热点，且HA在实践操作上更便捷，其应用价值更大。本研究采用脑外伤模型，旨在探讨HA对小鼠TBI的神经保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
60只8～9周龄健康雄性C57小鼠（由广西科技大学实验动物中心提供，合格证编号：2005A033），体重21.3～23.5 g，采用随机数字表法分为正常对照（NT）组、HA组、TBI组、HA+TBI组，各15只。NT组正常饲养，自由食水，照明7：00～19：00。其余3组按下述条件处理。饲养及实验过程中遵守实验动物管理与保护准则。
1.2 方法
1.2.1 HA方法 将小鼠暴露于38℃的动物实验舱内，2 h/d，不给食水，然后置于饲养环境中，连续刺激10 d。
1.2.2 TBI模型的建立 采用改良的自由落体撞击损伤装置建立小鼠TBI模型，具体方法：给小鼠腹腔注射10%（400 mg/kg）水合氯醛，麻醉起效后固定于鼠板上，碘酒消毒头皮，沿正中线从眼部至耳后切开并分离骨膜，暴露头骨。在冠状缝与人字缝连线中点向右3～5 mm处标记撞击点，使撞击杆从3 cm高处自由下落，使小鼠发生闭合性脑损伤。为防止呼吸抑制，术后立即将小鼠置于氧气箱中（20%O2+5%CO2）吸氧5 min，缝合头皮，置于25℃环境中复苏[3]。NT组和HA组不进行撞击，其余操作相同。
1.2.3 Fluoro Jade B（FJB）染色过程 FJB是一种荧光染料，与变性神经元的亲和力强，被认为是特异性标志变性神经元的有效方法。染色过程：经相应组别处理后的小鼠经4%多聚甲醛灌注固定，取脑组织进行冰冻切片，晾干后进行FJB染色及观察，具体步骤如下：1%NaOH与80%乙醇混合液浸泡切片5 min70%乙醇2 min双蒸水漂洗2 min0.06%高锰酸钾溶液15 min，在室温置于摇床上缓慢震荡双蒸水漂洗2 min新鲜配制的0.0004%FJB（美国Chemicon公司）工作液中避光浸泡30 min蒸馏水中漂洗3次，2 min/次梯度脱水、透明、抗荧光淬灭剂封片荧光显微镜下（激发光波长为450～490 nm）观察并采集图像。
1.2.4 脑组织含水量测定 按照实验分组条件处理24 h后处死小鼠，快速取出全脑，剥离脑膜并称重，随后置于105℃烤箱中烘烤至恒重（两次称重质量差≤ 0.2 mg），按照Elliott公式计算脑组织含水量：脑组织含水量=[（湿重-干重）/湿重]×100%。
1.2.5 脑组织苏木精-伊红（HE）染色 冰冻切片固定10～30 s稍水洗1～2 s苏木染色（60℃）30～60 s流水洗去苏木5～10 s1%盐酸乙醇1～3 s稍水洗1～2 s促蓝液显蓝5～10 s流水冲洗15～30 s0.5%曙红液染色30～60 s蒸馏水稍洗1～2 s80%乙醇1～2 s95%乙醇1～2 s无水乙醇1～2 s石炭酸二甲苯2～3 s二甲苯（Ⅰ）2～3 s二甲苯（Ⅱ）2～3 s中性树胶封固显微镜下观察并摄取图像。
1.3 观察指标
比较各组小鼠麻醉苏醒时间（从注射麻醉剂开始至有自主活动的时间）、苏醒后的一般行为学表现、脑组织含水量，脑切片HE染色观察病理学改变，FJB染色观察神经元变性情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠麻醉苏醒时间及苏醒后一般行为学观察
NT组小鼠的苏醒时间为（27.5±4.7） min，HA组和HA+TBI组分别为（28.1±5.3）、（43.7±11.5）min，最后苏醒的是TBI组小鼠，苏醒时间为（62.9±13.7） min。NT组与HA组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），提示HA不会延长小鼠的麻醉苏醒时间；HA+TBI组的苏醒时间均显著长于NT组和HA组，差异有统计学意义（P < 0.05），提示TBI可显著延长小鼠麻醉后的苏醒时间；与TBI组比较，HA+TBI组的苏醒时间明显缩短，差异有统计学意义（P < 0.05），提示HA可加快小鼠麻醉后的苏醒速度。苏醒后，NT组和HA组小鼠很快恢复正常活动，主动进食水，HA+TBI组小鼠行动欠稳定，平衡感稍差，TBI组小鼠苏醒后反应迟钝，活动明显减少，平衡能力差，提示经HA后的小鼠发生TBI时，脑损伤程度轻于未经HA的小鼠。
2.2 各组小鼠脑组织含水量比较
TBI组小鼠的脑组织含水量为（82.6±2.7）%，高于HA+TBI组[（77.8±2.1）%]、HA组[（72.3±1.5）%]和NT组[（72.5±1.8）%]，HA+TBI组高于HA组和NT组，差异均有统计学意义（P < 0.05），HA组和NT组比较差异无统计意义（P > 0.05）。结果表明，TBI可导致小鼠脑组织含水量显著升高，HA可显著减轻TBI导致的脑水肿程度，而HA不会增加脑组织含水量。
2.3 各组小鼠脑组织病理改变
各组小鼠脑组织切片HE染色结果见图1（封四），NT组和HA组小鼠的脑组织细胞结构清晰，未观察到细胞肿胀等明显异常现象；HA+TBI组和TBI组可观察到大量的细胞肿胀，胞质疏松，核明显固缩、破裂、溶解，染色质边集，部分细胞出现明显空泡化，且TBI组的空泡化细胞多于HA+TBI组，细胞结构异常程度更强。
2.4 各组小鼠脑组织神经元变性情况
各组小鼠脑组织切片FJB染色结果见图2（封四），发绿色荧光的为FJB阳性细胞。NT组和HA组有少量的FJB阳性细胞，HA+TBI组和TBI组阳性细胞明显增多，其中TBI组阳性细胞最多。
3 讨论
脑外伤后，局部组织发生继发性的缺血缺氧性损伤，导致神经细胞出现不可逆的损伤；机械性损伤可直接损伤脑细胞，使神经元发生直接死亡或促进程序性死亡，这两种损伤方式都可导致患者出现各种神经后遗症。因此，对神经损伤的防治是抢救TBI的重要环节之一。国内外诸多研究显示，适当的缺血缺氧预处理可以提高脑神经细胞对后续损伤的抵抗力，热预处理的保护效应是近年来国内外相关研究的热点，且热预处理在实践操作上更便捷，其应用价值更大。
目前常用的脑外伤研究模型有液压型、冻伤型及自由落体型。临床上最常见的脑外伤往往是经暴力所致，最长发生在高处坠落、交通事故等撞击事件中形成的闭合性脑损伤，因此自由落体型脑外伤模型更能代表临床上闭合性脑损伤的形成过程及病理特征[4-5]。本组研究在经典的脑外伤动物模型构建方法基础上，改进了自由落体装置，选用小鼠作为实验动物，经自由落体敲击损伤后，动物出现一般行为和神经功能障碍表现，出现明显脑水肿现象，且在细胞学上出现了明显的病理改变，神经元发生变性，表明本组研究的闭合性脑外伤模型构建是成功的，其研究结果可信。
有研究表明，HA有助于增强机体对缺血缺氧的耐受能力[6-9]。诸多实验研究结果表明，HA后，遭受缺血及缺氧/再灌注等损伤时，动物的心肌细胞损伤程度显著低于未经HA的动物[10-12]。也有研究指出，HA可显著减轻实验动物发生TBI时的损伤程度，有助于临床恢复[13-15]。但关于HA对脑损伤的保护机制，目前研究仍未阐述清楚。本研究显示，实验小鼠经HA后，遭受闭合性脑损伤时，其神经损伤程度明显轻于未经HA的小鼠，主要表现在麻醉苏醒更快，苏醒后一般行为状态更好，脑外伤导致的脑水肿程度减轻，细胞染色显示病理损伤和神经元变性减轻，表明HA对闭合性脑外伤具有神经保护作用。
综上所述，本研究能够在一定程度上证实HA对后续脑外伤确实具有一定的保护效应，为相关研究提供了参考依据。但关于其保护作用的机制，仍有待进一步研究，故在后续研究中，可对这种保护效应的作用途径进行探讨，从而发现HA保护效应的作用靶点或相关分子信号通路，为临床救治开拓新的方向。
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（收稿日期：2015-04-21 本文编辑：李亚聪）