酶联免疫吸附检测进展

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文章编号：1009-5519（2007）13-1963-02中图分类号：R446文献标识码：A

酶联免疫吸附测定 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)技术是1971年由Engvall 和Perlman 建立的一种生物活性物质微量测定新技术,以其灵敏度高、特异性好等优点,在生命科学各领域得到广泛应用。近年来，该技术不断改进，形成了多种分析方法，并且在检测的灵敏度、特异性、操作简单化、高效性等方面都有很大提高。ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性[1]。因此，ELISA法是一种既敏感又特异的方法。有报道441例梅毒患者的血清样品，认为ELISA的敏感性和特异性为100％和93％[2]。本文将ELISA的基本原理、类型、关键技术环节、国内外近年来ELISA的新技术综术如下：

1ELISA的建立

1.1抗体的制备：任何一种ELISA方法都需要抗体，因此在建立ELISA方法时都需要制备满足实验方法的抗体，抗体的制备是利用动物对外来异己的物质（抗原）的排斥作用发生免疫反应，在体液（血液）中产生针对该异己物质的免疫球蛋白，成为抗体，提取这些动物的体液就可以得到相应的抗体。抗原的种类很多，大小也不同，不同的抗原免疫动物具有不同的特殊性，一般情况当抗原的分子量较大时（大于5000D）才能诱导动物产生抗体，免疫动物时需用佐剂，如小分子激素或基因工程抗原等半抗原物质需先通过人工的方法与蛋白质载体连接后再与佐剂混合免役动物，方可获得理想的免疫效果，一些药物和激素的抗体都需经这个方法制得[3]。抗体的纯化方法有：中性盐沉淀、离子交换层析和亲和层析等方法。制备的抗体一般需要进行特异性和亲和力的鉴定。

近年来，随着单克隆抗体技术的发展，在ELISA方法中越来越多的应用单克隆抗体。单克隆抗体是由B细胞杂交瘤细胞株产生的，只针对一种抗原决定簇的单一抗体。是将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合成杂交瘤细胞，这种细胞能在人工培养下无限增殖，又能产生特异性抗体[4]。单克隆抗体的优点是：理化性质高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、来源容易等。他的应用大大提高了ELISA方法的选择性和特异性，同时也是大量提供标准化抗体的一个途径。

1.2ELISA的标记技术：标记是ELISA检测方法的关键技术。好的酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，产量高及成本低。常用的酶有碱性磷酸酶（简称AP），辣根过氧化酶（简称HRP），此外还有葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖甙酶，葡萄糖氧化酶、青霉素酶及乙酰胆碱酯酶等[5]。（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而连结。戊二醛法分为一步法和二步法。一步法容易形成高分子量的酶和酶标抗体聚合物，以及形成不稳定的酶标抗体；二步法也形成高分子量的复合物，但酶与抗体的分子比为1∶1，特别适用于定量ELISA。AP和HRP一般用戊二醛法与抗体交联。（2）过碘酸钠法：过碘酸钠法标记的的酶标抗体是一个高分子量的复合物，也常用于定量ELISA法，有较高的灵敏度。此方法的标记率在70%左右，是目前最常用的方法。本方法只用于HRP的交联，是HRP交联最有效的方法。但是由于此法所用试剂较为剧烈，各批实验结果不易重现。除此之外还有二来酰亚胺法、二异氰酸甲苯法、氟二硝基砜法、苯醌法等。但是都比较少用。交联反应的选择与实验条件和实验者的经验有关。

2ELISA的主要类型

2.1双抗体夹心法：用于检测抗原。本法首先用特异性抗体包被于固相载体，利用待测抗原上的两个抗原决定簇分别与固相载体上的抗体和酶标记抗体结合，形成抗体-待测抗原-酶标抗体复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比。此方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位。因此，不能用于分子量小于5 000的半抗原的测定。此法在霍乱肠毒素、HBsAg及HbS的测定中有应用。陈松等[6]用抗体夹心ELISA 法直接检测转基因植物体内Ｂｔ毒蛋白含量，认为其简便、灵敏、准确。

2.2改良双抗体夹心法：也是用于测定抗原的，其原理见图1。与改良前的双抗夹心不同之处在于本法也是首先将特异性抗体a包被于固相载体，抗原与特异性抗体a结合后再与特异性抗体b结合，而这次加入的抗体b于第一次包被于固相载体上的特异性抗体a对被测抗原来说都是特异性的，但不是用同种动物免疫制备的，否则可出现非特异性反应。形成抗体a-待测抗原-抗体b复合物，此复合物再与酶标记抗b抗体结合。

图1改良双抗体夹心法测抗原示意图

这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，放大的倍数更高，故比双抗体夹心法更加灵敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗体，即可达到多种应用。

2.3间接法：用于测定抗体。将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比。

2.4竞争法：既可用于检测抗原又可用于检测抗体。方法的基本原理见图2（以测定抗原为例）：首先将特异性抗体（抗原）吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，由于酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。

这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。

3ELISA的新技术

3.1斑点ELISA法：斑点ELISA试验（Dot-ELISA）又称点免疫结合法或抗原斑点试验，是Hawkes等参照核酶的斑点杂交法改良而成的,是以纤维素膜为载体的一种新型免疫检测技术[7]。已被广泛应用于免疫印记单克隆抗体鉴定及各种抗原-抗体体系的检测。也有报道用白色PVC作快速Dot-ELISA载体来检测日本血吸虫抗体。其实验效果不仅与NC膜做载体的常规ELISA无异，而且有许多优点，载体和容器合一，操作方便；孔底薄吸热性好，有利于各试剂快速结合；点抗原不扩散，斑点色度增加等[8]。

3.2单克隆抗体捕获ELISA法：单克隆抗体捕获ELISA法（Mac-ELISA）是在抗体捕获试验基础上近几年发展起来的一种检测技术，他可以避免同型抗体间对抗原位点的竞争而敏感性差的问题也可以避免如类风湿因子（RF）等引起的非特异性反应，敏感性和特异性强。Florent等成功的将此种方法应用于牛呼吸道病毒感染的IgM抗体检测，Lee等应用HBDV的单克隆抗体通过Mac-ELISA检测出HBDV的特异性抗体。

3.3聚合酶链式反应ELISA法：聚合酶连式反应（PCR）是分子生物学技术检测DNA最灵敏的方法之一，而酶联免疫吸附测定法（ELISA）是免疫学中最敏感和特异的检测方法的代表。聚合酶链式反应ELISA法（PCR-ELISA）集合了上述两种方法的精髓，成为继PCR之后的又一个灵敏性更高、特异性更强、省时易行的新方法[9]。

4研究展望

ELISA具有灵敏度高、特异性强等优点, 自问世以来，迅速得到推广。ELISA分析方法多样，适用面广，广泛的用于抗原、抗体和半抗原的免役测定。其线性范围较宽，符合临床检验的要求，ELISA技术为临床诊断和科学研究提供了一种超微量的非同位素免役检测手段，在医学、食品分析、药物残留、环境等方面具有广阔的应用前景。目前，ELISA在免役分析方面取得了一些成就，但其远不能满足临床分析的要求。研究者在如何提高免疫诊断的敏感性和特异性，发展新的分析技术等方面仍在不断努力。ELISA技术的发展趋势在于优化抗体制备和标记技术以及建立新的免疫分析方法等；在新的分析方法原理上力求创新，追踪生命科学和环境科学发展的前沿领域，建立对生命过程和环境毒理有重要内源性和外源性物质分析的新方法，促进生命科学、环境科学的研究和发展。

参考文献：

[1]关秀茹，辛晓敏.现代临床检验技术与应用[M].北京：科学出版社， 2005.213.

[2]Schrnidt B L. EdilalipourM，Luger A. Comparative evaluation of nine differentenzyme-linked immunosorbentassays for determination of antibodiestreponemapallidum in patients with primauy syphilis [J]. Clin Microbiol，2000，38(3)：1279.

[3]李振甲，王仁芝. 激素的放射免疫分析[M].北京：科学技术出版社， 1985.24.

[4]钱玉昆.临床免疫学[M].北京：北京医科大学,中国协和医科大学联 合出版社，1994.145.

[5]焦奎,张书圣.酶联免疫分析技术及应用[M].北京：化学工业出版 社，2004.98.

[6]陈松，张震林，张香桂，等. ELISA方法鉴定转Bt基因抗虫棉[J].江 苏农业科学，2003，1：21.

[7]刘国霞，曾先垠.酶联免疫吸附测定技术新进展[J].河南畜牧兽医， 2001，22(7)：13.

[8]曾明安，黄启华，毛勇.白色PVC薄膜快速Dot-ELISA检测日本血 吸虫抗体[J].上海免疫学杂志，1995，15(2)：108.

[9]汤仲明，刘秀文，宋海峰，等.重组蛋白质多肽药物的临床药代动力 学[J]，中国新药杂志，2002，11(10)：750.

收稿日期：2007-03-02修回日期：2007-03-14

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