抑制miR181b通过上调PKG―1减轻大鼠心肌细胞肥大

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【摘要】 目的：通过检测miR181b在心肌肥厚患者外周血中的表达，研究miR181b与PRKG-1在心肌肥大中的作用机制，为心肌肥厚临床诊断和治疗提供新的靶点。方法：采用实时定量PCR方法检测50例临床诊断为心肌肥厚患者及25例正常健康人的外周血miR181b的水平，分析其表达水平与临床病理特征的关系。结果：miR181b在心肌肥厚患者外周血中表达（3.35±0.22）升高，差异有统计学意义（P

【关键词】 心肌肥大； 心室重构； miR181b； PRKG1

心肌肥厚是很多慢性疾病的一个共同的临床病理性改变，主要发生在长期压力负荷过重的情况下，作为一种代偿方式。但这种代偿功能也有其不利之处，主要因为肥大的心肌需氧增加，而冠状动脉的供血量往往不能给予满足，造成心肌缺血，这将最后导致心肌收缩力的减退，是导致患者心衰进而引起死亡的重要原因[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 心肌肥大患者外周血采集 收集2012年1月-2014年3月在本院治疗的50例经心脏超声诊断有心肌肥厚的患者，男40例，女10例，年龄64～72岁，平均68.5岁，中位年龄67岁。根据高血压临床分级标准，50例患者经临床诊断均为高血压2级，病程均>5年，同时取25例健康人外周血清作为对照组。本研究经过枣庄市立医院伦理委员会批准，并得到受试者家属的知情同意。

1.1.2 试剂 血清RNA抽提试剂Trizol ls购自Invitrogen公司（加州、美国），组织细胞总RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen公司（加州、美国），兔抗鼠pkg1多克隆抗体购自Santa cruz公司（波士顿、美国），Takara PrimeScript RT Regent Kit反转录试剂盒（大连、中国）；TaKaRa公司SYBR PrimeScript RT-PCR Kit荧光定量（大连、中国）；L-DMEM、MCDB131、胎牛血清（FBS）：美国GIBCO公司。α-横纹肌肌动蛋白抗体（α-sarcomeric actin antibody，α-SA），DAPI（Santa Cruz，美国）。去氧肾上腺素（PE）（Sigma-Aldrich，美国）；lipofectamine 2000购自Invitrogen （加州、美国）。

1.2 方法

1.2.1 血清总RNA提取 将患者外周血3000 r/min

离心10 min，取上清；吸取血清250 μL，加入

750 μL Trizol ls充分混匀，均采用酚氯仿法提取总RNA，分别通过RNA分子电泳、紫外分光光度计分析RNA 260/280比值检测RNA质量，取总RNA 1 μL，采取PolyA加尾法对miRNA进行逆转录；cDNA于-20 ℃冰箱保存。相关miRNA的逆转录按下列程序进行，在冰上预冷的RNase free EP管中加入RNA模板6 μL，2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，0.1% BSA 2 μL，miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL，总体积20 μL，37 ℃孵育60 min进行PolyA加尾和反转录反应，随后向上述RT反应液添加RNAase Free H2O 至100 μL，取

2 μL进行定量检测。

1.2.2 SYBR Green荧光定量PCR 荧光定量PCR技术检测外周血中miR181b的表达水平，根据TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit试剂盒说明书配置反应体系：10 μL qRT-PCR-Mix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1 μL的cDNA 和8 μL ddH2O配置，每个样品设3个平行孔。反应程序为：预变性95 ℃ 10 min，40个循环：95 ℃ 1 min， 60 ℃ 30 s溶解程序验证特异性：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s， 95 ℃ 15 s，内参基因采用U6。

1.2.3 心肌细胞的原代培养 取新生3 d的大鼠乳鼠，取出心室部位心肌组织，用眼科剪将其剪碎后，加入5 mL 0.5%胰蛋白酶和0.5%Ⅱ型胶原酶混合配成的消化液，37 ℃水浴消化5 min，取上清至含有2 mL小牛血清的离心管中，重复以上步骤2次，200 g离心5 min，弃去上清后，加入5 mL含10%胎牛血清的H-DMEM培养基，将细胞吹散并接种于25 mL培养瓶中，37 ℃，5%CO2孵箱中培养。

1.2.4 心肌细胞免疫组化 使用细胞爬片方法，制作心肌细胞切片，4 ℃下用冰丙酮固定1 h后，去离子水冲洗5 min，重复3次；用过氧化氢避光浸泡玻片20 min后，PBS冲洗两次；滴加羊血清（1∶200），37 ℃封闭1 h。滴加稀释的α-横纹肌肌动蛋白抗体（1∶200），4 ℃过夜；次日PBS清洗玻片3次，滴加FITC标记兔抗大鼠2抗（1∶200），37 ℃下孵育

30 min，加DAPI，孵育5 min后采用激光共聚焦显微镜、倒置相差荧光显微镜下观察心肌细胞及荧光表达。

1.2.5 心肌肥大细胞模型的构建 心肌细胞原代培养第2天，向培养基中加入终浓度为100 μM的PE培养72 h，通过细胞免疫组化、细胞总蛋白量测定、心肌肥大相关基因检测、流式细胞术检测心肌细胞大小的方法对心肌肥大模型进行评估。

1.2.6 心肌细胞中miR181b与prkg1 mRNA的表达 搜集PE组及对照组心肌细胞，采用TRIzol法抽取RNA，逆转录为cDNA后，采用SYBR Green法检测心肌细胞miR181b与prkg1 mRNA的表达，prkg1 mRNA的定量PCR体系按照如下标准配置：SYBR EX Taq 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5μL，模板cDNA 2μL，ddH2O 10.5 μL；prkg1 mRNA 定量PCR反应条件：预变性95 ℃ 10 s；40个循环：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s。

1.2.7 心肌细胞中PKG1蛋白的表达 收集PE组、对照组的细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，制备细胞蛋白上清，与2×SDS上样缓冲液等量混合，沸水浴5 min后10 μL/孔上样，行100 V恒压SDS-Page电泳，300 mA恒流2 h冰浴电转至PVDF膜，50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h，加入适当浓度一抗（PKG1∶1000，GAPDH 1∶5000），4 ℃摇床孵育过夜，次日用PBST漂洗15 min×3次，加入HRP标记的二抗（羊抗鼠1∶3000，羊抗兔1∶1000）室温孵育1 h，PBST漂洗15 min×3次，ECL发光液显影曝光。

1.2.8 miR181b inhibitor转染心肌细胞 采用脂质体法转染原代心肌细胞。实验分为对照组、NC、miRNA181b inhibitor组，均培养于不含抗生素10%胎牛血清的H-DMEM培养基，次日开始转染，取20 pmol/μL miR181b inhibitor 1.5 μL，lipo2000 1 μL分别加入含50 μL Opti Memi培养基的EP管中静置5 min后，将两管混匀，室温下静置20 min后加入培养孔，6 h后更换10%胎牛血清的H-DMEM培养基，采用定量PCR、WB检测48 h和72 h的各组细胞miRNA-181b及prkg1基因和蛋白PKG1表达水平；BCA法测定细胞总蛋白量、并通过流式细胞术检测细胞大小、采用定量PCR检测心肌肥大相关基因表达，观察转染前后心肌肥大的变化。

1.3 统计学处理 使用SPSS 15.0统计学软件分析数据，计量资料用（x±s）表示，比较使用成组t检验，P

2 结果

2.1 qRT-PCR检测心肌肥大外周血中miR181b表达 使用SYBR Green法分别检测心肌肥厚患者与健康人外周血miR181b的表达，结果显示健康人外周血中miR181b表达（1.12±0.21），心肌肥厚组（3.35±0.22）较健康人明显升高，比较差异有统计学意义（P

2.2 原代心肌细胞的培养、心肌肥大细胞模型构建及鉴定 镜下观察原代乳鼠心肌细胞呈典型多角形，用α-横纹肌肌动蛋白抗体和DAPI对其进行免疫荧光染色后，在激光共聚焦显微镜和倒置相差免疫荧光显微镜下观察，心肌细胞呈现长梭形，呈节律性的收缩，蓝色为染色的细胞核，绿色荧光为细胞浆，绿色荧光细胞达到了90%以上，表明原代心肌细胞状态好，纯度高。终浓度为100 μM的PE处理原代心肌细胞72 h后，细胞免疫组化结果显示与对照组相比，原代心肌细胞显著肥大；PE组细胞总蛋白含量（180.22±10.21）显著升高，比较差异有统计学意义（P

2.3 PE组心肌细胞miR181b与prkg1 mRNA与蛋白PKG1表达 荧光定量PCR检测结果显示，与对照组（1.02±0.11）细胞相比，PE组miR181b表达（3.82±0.20）显著升高，差异有统计学意义（P

2.4 miR181b与PKG1蛋白表达对PE组心肌细胞的影响 使用定量PCR及Western blot检测转染miR181b inhibitor后PE组心肌细胞中miR181b及prkg1 mRNA和蛋白的表达，结果显示转染组miR181b的表达（0.25±0.14）下调，差异有统计学意义，而prkg1 mRNA（1.28±0.13）未见明显改变；PKG1蛋白表达（3.12±0.14）显著增高，差异有统计学意义；对转染miR181b inhibitor的PE组心肌细胞肥大特征分析发现，miR181b表达下调后，心肌细胞总蛋白含量（138.28±15.13）下降；流式细胞术分析发现心肌细胞变小；心肌肥大相关基因β-MHC（0.58±0.16）、α-SA（0.49±0.26）、ANP（0.67±0.24）表达降低，差异有统计学意义。

3 讨论

心肌肥厚（Cardiomyocyte hypertrophy）是一种强有力的代偿形式，然而它不是无限度的，如果病因历久而不能被消除，则肥大心肌的功能便不能长期维持正常而终转向心力衰竭。目前认为，代偿性心肌肥大是一种不平衡的生长形式。这种在器官、组织、细胞、分子等不同的水平上都有其特征性表现的不平衡生长[2]，是肥大心肌转向功能不全的基础，是大多数心血管疾病发生发展中常见的一种病理生理变化，主要是因心脏的前后负荷的改变引起心肌细胞的适应性反应，若不加以临床治疗，最终将引起心肌纤维化导致心脏衰竭的发生。

心肌肥厚发生的分子机制非常复杂，涉及到了多种基因表达及蛋白功能的改变。研究表明，在机体压力负荷增加时，心肌细胞出现肥大改变，细胞内表现为蛋白合成增加、ATP分子合成旺盛、离子通道活性增强等[3-5]，是一种代偿性的应激反应。但是若心肌细胞持续处于肥大病理状态，会导致细胞基因表达及蛋白合成失调，线粒体、内质网等细胞器的损伤[6]，最终出现心肌细胞的死亡及间质的纤维化，导致了心脏衰竭的发生。已有文献显示，在心肌肥大的过程中，miRNA也起到了重要的调控作用，具有较复杂的作用机制[7]。研究表明，心肌细胞中miR-1上调能够调节心肌组织连接蛋白43的表达，从而抑制心肌肥大[8]。另一种miRNA分子-miRNA133被证实能够抑制肾上腺素及内皮素诱导的心肌肥大，其在肥大心肌细胞中表达下调[9]。此外文献[10]报道，miR-98、miR-9与心肌肥大的发生发展密切相关。

综上所述，可以认为mir181b可能通过调控prkg1基因的表达在心肌肥大过程中发挥重要作用。miR181b在心肌肥大患者外周血中表达升高；其表达下调后，原代肥大心肌细胞有逆转的迹象，提示miR181b可能成为心肌肥厚的临床诊断和治疗上一个新靶点。

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（收稿日期：2015-09-02）