铁皮石斛专属性成分的分离制备及质量标准研究
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[摘要] 采用色谱和光谱技术首次从铁皮石斛追踪分离并鉴定专属性成分佛莱心苷。对铁皮石斛药材粉末特征进行描述。采用薄层色谱法对铁皮石斛中佛莱心苷进行定性分析，硅胶SGF254薄层板，展开剂乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（4∶3∶1∶1），显色剂三氯化铝，结果铁皮石斛中佛莱心苷的薄层色谱鉴别特征明显，具有一定专属性，可实现铁皮石斛药材与易混淆的齿瓣石斛、杯鞘石斛、兜唇石斛等石斛的加工品区分鉴别。对铁皮石斛的粉末特征进行描述。采用高效液相色谱法对铁皮石斛药材中的活性成分柚皮素进行定量分析，Bischoff Chromatography HIPAK NC-04 ODS AB色谱柱（4.4 mm × 250 mm，5 μm），流动相乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱，检测波长226 nm，柱温25 ℃；结果柚皮素的定量测定在3.90～250.00 mg・L-1呈良好的线性关系，r=0.999 9；平均回收率99.20%（RSD 0.17%），20批铁皮石斛药材质量分数在0.190～0.498 mg・g-1。所建立的定性和定量方法简单灵敏，准确可靠，重现性好，为提高铁皮石斛的质量控制方法提供了实验依据，对于保证其质量和临床疗效具有重要意义。
[关键词] 铁皮石斛；佛莱心苷；柚皮素；显微鉴别；薄层鉴别；含量测定；质量标准
[Abstracts] The violanthin， a specific component， was separated and identified from the stems of Dendrobium officinale by chromatographic technique and spectroscopic method for the first time. The microscopic characteristics of D. officinale powder were examined under a microscopy and described. Thin layer chromatography （TLC） method was used for qualitative analysis of the violanthin from D. officinale stems with a mixture of ethyl acetate， butanone， formic acid and water （4∶3∶1∶1） as the developing solvent on high performance silica gel precoated plate （SGF254） and using aluminium trichloride as a chromagenic agent. The results showed significant characteristics of violanthin from D. officinale stems on TLC， with certain specificity， and could be used to distinguish it from other easily confusing processed medicinal stems of D. devonianum， D. gratiosissimum and D. aphyllum. The content of naringenin， an active ingredient in D. officinale stems was determined by HPLC analysis on a Bischoff Chromatography HIPAK NC-04 ODS AB column （4.4 mm×250 mm， 5 mm） with acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution as the mobile phase for gradient elution. The wavelength was set at 226 nm and column temperature was 25 ℃. The HPLC method showed good linearity within the range of 3.90-250.00 g・mL-1 （r = 0.999 9） for naringenin. The average recovery of naringenin was 99.20% with 0.17% of RSD. The mass fraction of 20 batches of D. officinale stems was between 0.190 and 0.498 mg・g-1. The established qualitative and quantitative method was simple and rapid with good repeatability and accuracy， providing experimental basis for improving the quality standard of D. officinale， with a very important significance to ensure its quality and clinical effect.
[Key words] Dendrobium officinal；violantin；naringenin；microscopic identification；TLC；content determination；quality standard
doi：10.4268/cjcmm20161318
中药石斛为我国常用的珍稀中药，始载于《神农本草经》，铁皮石斛Dendrobium officinale为其中最为珍稀名贵的品种之一，以其茎加工的铁皮枫斗是国家法定的唯一枫斗正品，被历版《中国药典》所收载。鉴于其长期的临床药用价值与市场价值，以及有别于黄草类石斛的加工方法与用药，自2010年起，《中国药典》将铁皮石斛从石斛项下分列[1-2]，单独记载。铁皮石斛具有益胃生津，滋阴清热等功效，临床上常用于缓解人体疲劳、增强免疫力、改善胃肠道功能、治疗糖尿病与辅助抗肿瘤等，是我国远销国内外的珍稀名贵中药品种。
铁皮石斛是我国特有的珍稀濒危物种[3]，由于野生资源稀缺，人工栽培成本高，药材市场上常出现以其他石斛属植物如齿瓣石斛D. devonianum加工的紫皮枫斗，兜唇石斛D. aphyllum加工的水草枫斗，杯鞘石斛D. gratiotissinum加工的刚节枫斗等冒充销售，造成药材来源混乱，质量不一[4-5]。从《中国药典》1985年版收载铁皮石斛至现行版，均没有专属性指标成分用于质量标准研究，不能解决铁皮石斛品种鉴别问题，而现行质量标准仅以多糖为指标也不能全面的反应铁皮石斛内在质量。
本研究通过化学成分的追踪分离，首次从铁皮石斛茎中分离得到具有一定专属性的化合物成分佛莱心苷，并以此为参照建立专属性的定性分析方法。对铁皮石斛的粉末特征进行描述，建立药效成分柚皮素的定量分析方法。通过上述研究完善现行的质量标准，为提高铁皮石斛的质量控制方法，解决其基原混乱，保证药材质量提供科学依据，具有重要的意义。
1 材料
核磁共振光谱仪（Bruker，AV-400/600型，德国），LCQ DECA XP Plus ESI-MS 型质谱仪（Thermo Finnigan公司），1260型液相色谱仪（美国安捷伦公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、检测器、工作站），薄层色谱自动点样器（Linomat-Ⅵ，瑞士CAMAG公司），薄层色谱摄像仪（Reprostar 3，瑞士CAMAG公司），J26光学显微镜 （Olympus bx41，日本奥林巴斯公司），Sartorius BSA124S-CW电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司），Sartorius BT25 S电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司），DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），KQ-250DB数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。
乙腈（色谱纯，美国Fisher公司），磷酸（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。高效预制薄层板Merck HSG F254（德国Merck），高效硅胶预制薄层板HSG F254（烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂），高效硅胶预制薄层板HP MN F254（德国MN），高效硅胶预制薄层板 HSG F254（烟台化学工业研究所），预制薄层板Merck SG F254（德国Merck），硅胶预制薄层板MN SG （德国MN），硅胶预制薄层板MN F254（德国MN），硅胶预制薄层板SG F254（烟台化学工业研究所）。
铁皮石斛药材（铁皮枫斗）20批，齿瓣石斛药材（紫皮枫斗）5批次，兜唇石斛药材（水草枫斗）2批，杯鞘石斛药材（刚节枫斗）2批。由上海中医药大学徐红研究员及上海中药标准化研究中心吴立宏研究员收集并鉴定，标本保存在上海中药标准化研究中心，样品信息见表1。柚皮素对照品（上海中药标准化研究中心提供，纯度>98%）。
2 方法与结果
2.1 佛莱心苷的分离与结构鉴定
由于铁皮石斛现行质量控制方法一直没有专属性的指标成分，本研究通过比较铁皮石斛与紫皮石斛的薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）行为，确定了铁皮石斛专属性成分，并运用MCI柱色谱、凝胶分子筛和制备液相等化学分离方法，针对铁皮石斛中的专属性成分进行追踪分离制备。新鲜铁皮石斛茎10 kg，用8倍量70%乙醇加热回流提取4次，每次2 h，合并提取液，减压回收溶剂，浓缩后加水混悬至1 L，然后用石油醚萃取4次，每次1.5 L，
浓缩石油醚层，取下层水层继续用乙酸乙酯萃取4次，每次1.5 L，浓缩乙酸乙酯层，取下层水层挥干有机试剂，稀释至1 L，经MCI柱色谱，由水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、纯甲醇洗脱，共得到5个部分。经TLC检测（展开剂为乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水4∶3∶1∶1）后，可发现铁皮石斛的专属性成分在50%甲醇段。将MCI的50%甲醇段经Sephadex-LH-20凝胶柱色谱，纯甲醇系统洗脱，经TLC检测合并，共得到5个流份Fr.1～Fr.5，Fr.3和Fr.4经TLC检测均含有铁皮石斛专属性成分，故而将它们合并后经制备液相纯化，流动相乙腈-水4∶86，最终得到专属性化合物TPSH-03，经1H，13C-NMR，HMBC，HMQC谱鉴定，并对照文献报道的化合物波谱数据[6]，鉴定化合物TPSH-03为黄酮碳苷类化合物佛来心苷（violanthin），该化合物为首次从铁皮石斛和石斛属中分离得到，结构见图1。
2.2 显微鉴别
粉末。束鞘纤维多排列成束或散离，几无色或淡黄色，直径8～33 μm，壁厚，胞腔较狭窄；有时周围细胞含有类圆形硅质块，排列纵行，直径6～23 μm；偏光显微镜下呈亮白色或亮黄色。草酸钙针晶多成束存于薄壁细胞中，也可见散在的针晶，针晶粗大，长约至170 μm；偏光显微镜下呈多彩状。表皮细胞表面观呈类多角形或长多角形，垂周壁连珠状增厚。导管主要为网纹、梯纹导管，少数为网状具缘纹孔导管，直径6～45 μm，见图2。
2.3 薄层色谱鉴别
2015年版《中国药典》以对照药材为参照的TLC鉴别方法，缺乏指标性成分，专属性不强，不能将铁皮石斛与常见易混淆枫斗区分鉴别，见图3；基于课题组分离制备的铁皮石斛具有一定专属性的化合物佛来心苷，以及在枫斗类石斛中具有普遍分布的黄酮类成分夏佛塔苷为对照，建立了不同于《中国药典》的TLC新方法，可实现铁皮石斛药材与同属易混淆的紫皮枫斗（齿瓣石斛加工）、刚节枫斗（杯鞘石斛加工）、铁皮扁兰枫斗（大苞鞘石斛D. wardianum Warner）、小黄草枫斗（粉花石斛D. loddigesii Rolfe加工）、水打棒枫斗（报春石斛D. primulinum Lindl.加工）、水草枫斗（兜唇石斛加工）区分鉴别，见图4。
2.3.1 对照品溶液的制备 分别取佛来心苷、夏佛塔苷对照品1 mg，加甲醇10 mL溶解，经0.45 μm微孔滤膜滤过，制成每1 mL含有0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。
2.3.2 供试品溶液的制备 取铁皮石斛粉末1.0 g，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL使溶解，用乙酸乙酯洗涤2次，每次30 mL，弃去洗液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加少量甲醇溶解，经0.45 μm微孔滤膜滤过，最后定容至1 mL，作为供试品溶液。
2.3.3 点样与展开 取上述供试品溶液5 μL、对照品溶液1 μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板（HSGF254）上，使成条状，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（4∶3∶1∶1）为展开剂，展开，取出，烘干，喷以三氯化铝试液，在105 ℃烘2～3 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。
2.4 HPLC含量测定
2.4.1 色谱条件 Bischoff Chromatography HIPAK NC-04 ODS AB色谱柱（4.0 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱（0～5 min，25∶75；5～40 min，25∶75～60∶40）；柚皮素检测波长为226 nm；进样量10 μL；流速1.0 mL・mim-1；理论板数按柚皮素峰计算应不低于5 000。在此条件下，柚皮素与其他组分达到基线分离，见图5。
2.4.2 对照品溶液的制备 取柚皮素对照品5 mg，精密称定，加甲醇50 mL制成每1 mL含0.1 mg的对照品溶液，即得。
2.4.3 供试品溶液的制备 取铁皮石斛粉末（过4号筛）约1 g，置500 mL圆底烧瓶中，加入甲醇200 mL，加热回流提取2 h，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL溶解，作为供试品溶液。
2.4.4 测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.4.5 线性关系考察 取柚皮素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含柚皮素0.25 g・L-1对照品贮备溶液。分别精密吸取不同体积的对照品储备溶液，制成3.90， 7.80， 15.60， 31.25， 62.50， 125.00， 250.00 mg・L-1不同浓度的系列溶液，按上述色谱条件测定，进样10 μL，分别以对照品的浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，得回归方程为Y=9.724 1X-5.414 6，r=0.999 9，表明柚皮素在3.90～250.00 mg・L-1呈良好的线性关系。
2.4.6 检测限和定量限 精密量取已知浓度的对照品溶液，依次稀释制成系列浓度由高到低的溶液，测得柚皮素的检测限（S/N=3） 为3.85 ng，定量限（S/N=10） 为5.73 ng。
2.4.7 精密度试验 分别取高、中、低3种浓度的柚皮素对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，记录柚皮素色谱峰的峰面积并计算峰面积的RSD分别为0.060%，0.21%，0.26%，表明日内精密度良好。连续3 d测试，计算峰面积的RSD分别为0.35%，0.18%，0.71%，表明日间精密度良好。
2.4.8 重复性试验 取同一铁皮石斛样品粉末6份，精密称定，按2.4.3项下操作，在上述色谱条件下进样测定，计算柚皮素色谱峰的峰面积及其相对标准偏差RSD，结果RSD为0.30%，表明方法重复性良好。
2.4.9 稳定性试验 取铁皮石斛样品粉末约1 g，精密称定，按2.4.3项下操作，在上述色谱条件下，分别于0，2，4，8，12，24，48 h测定，记录柚皮素色谱峰的峰面积计算，结果峰面积的RSD为1.3%，结果表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。
2.4.10 加样回收率试验 取已知含量的铁皮石斛样品粉末9份，约0.5 g，精密称定，分别按已知含量的50%，100%，150%加入柚皮素对照品，按2.4.3项下操作，在上述色谱条件下进样测定并计算加样回收率，平均回收率为99.2%，RSD为0.17%，见表2。
2.4.11 样品测定 分别取铁皮石斛样品粉末约1 g，精密称定，按2.4.3项下操作，制成供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定，按干燥品计算柚皮素的含量，结果见表1。
3 讨论
铁皮石斛现有的质量标准缺乏专属性成分，不能实现与常用混淆品的有效鉴别。基于薄层色谱，确定铁皮石斛大极性部位（主要是黄酮类）具有专属性成分。运用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、薄层色谱和高效液相色谱等多种分离方法，得到1个化合物，经质谱和核磁数据鉴定为黄酮碳苷类化合物佛来心苷，该化合物首次从铁皮石斛中分离获得。目前研究发现，佛来心苷只存在于铁皮石斛药材中，在其余易混淆的齿瓣石斛、杯鞘石斛、兜唇石斛等石斛加工品中未见，具有一定专属性。
2015年版《中国药典》的薄层色谱方法以对照药材为参照，薄层色谱的专属性不强，不能将铁皮石斛与常见易混淆品区分鉴别。本研究建立的薄层色谱方法，以专属性成分佛来心苷为对照，分离度高，斑点信息丰富，实现了铁皮石斛药材与市场上常见的同属易混淆药材的定性鉴别。
2015年版《中国药典》采用比色法对铁皮石斛多糖进行定量分析，无基于HPLC的定量分析方法。本研究分离鉴定的专属性成分佛来心苷，虽具有抗氧化、乙酰胆碱酯酶抑制活性等药理作用[7-8]，但含量低于万分之二。根据药典质量标准制定技术指导方案，含量低于万分之二的化学成分不适合做中药质量控制的指标性成分，因此需选择其他药效成分作为铁皮石斛质量控制的指标性成分。文献报道铁皮石斛中含量较高的黄酮类化合物柚皮素具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗纤维化等多种与铁皮石斛中医药传统疗效相关的药理活性[9]，是铁皮石斛中含量较高的药效成分。对其定量测定虽已有文献报道[10]，但尚未见系统评价铁皮石斛药材（铁皮枫斗）质量的相关报道。为完善现行质量标准，建立了柚皮素的定量分析方法。考察了提取方法（冷浸、超声、冷浸1 h后超声、加热回流）和提取时间，比较了不同品牌色谱柱[Shiseido CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ（4.0 mm×250 mm，5 μm），Bischof HIPAK ODS AB NC-04（4.0 mm×250 mm，5 μm），Shanghai Xuanmei industry Co. Ltd. SHARPSIL-T C18 T180105-040250（4.0 mm×250 mm，5 μm）]、检测波长（226～280 nm）、体积流量（0.2～1.2 mL・min-1）。按定量测定色谱条件以及改变色谱条件后进行测定，测得柚皮素含量以及相对标准偏差（RSD
应用所建立的分析方法对20批铁皮石斛药材进行定量分析，结果表明各批次样品均可检出柚皮素，不同产地的样品中含量具有一定差异， 有必要进行质量控制。在此研究基础上建议铁皮石斛按干燥品计算含柚皮素（C15H12O5）不得少于0.022%。
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