青霉素结合蛋白
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青霉素结合蛋白(PBPs)是广泛存在于细菌表面的一种膜蛋白，是β_内酞胺类抗生素的主要作用靶位。不同细菌其种类及含量均不相同。但各种菌种的PBPs又有许多类似的结构与功能，在细菌生长、繁殖中发挥重要作用。PBPs结构与数量的改变是产生细菌耐药的一个重要机制。现今，各类抗生素虽种类繁多，但在耐药菌的治疗中仍缺乏有效手段。因此近年来围绕PBPs开展了大量的研究工作，试图从分子结构与基因水平认识PBPs，探求细菌耐药的机制，企图获得更有效的治疗手段。
1PBPs研究简史及基本概念
尽管临床上很早就开始应用青霉素，但到20世纪50年代，人们才认识到青霉素是通过干扰细菌的表面结构而起作用的。60年代，细菌细胞壁的结构被阐明，为人们认识青霉素作用机制及PBPs奠定了基础。1972年Suginak.Blumberg和Strominge:发现青霉素结合蛋白，用放射性同位素标记的青霉素可以标出细菌表面的PBPs，但后来的研究发现并非所有PBP均是青霉素作用的致命靶位。所有细菌都含有多种青霉素结合蛋白，不同菌属其PBPs含量、种类各不相同，不同的抗生素通过与不同的PBP蛋白结合而产生不同的抗菌活性。因此，与不同PBP结合的抗生素可联合应用，往往产生协同作用。
每个菌种都有一套特异的PBPs，称PBPs谱。在一种菌种中PBPs按分子量大小排序，分别称PBPI,PBP2,PBP3......。PBPl为分子量最大的一种。不同菌属PBPs的生理功能很相近，而且分子结构上也有其相关及相似性。PBPs含量很少，仅占细胞膜蛋白总量的1%，不同PBP含量变化很大，如大肠杆菌中高分子的PBPI,PBP2和PBP3量很少，而低分子PBPS和PBP6却占PBPs量的70%—90%。各种PBP与抗生素亲和力相差亦很大。亲和力大小一般用。表示;指使-青霉素G结合减少50%时该抗生素浓度，其值越高，示药物亲和力越小。
研究PBPs的方法与技术不断地发展。比如现已用分子生物学方法研究PBPs分子结构，基因构成与变异，通过基因重组研究PBPs功能等。但传统的方法仍是研究的基本方法，比如用超声技术粉碎细菌，离心分离胞膜，用TritonX-100从胞膜中分离PBPs,用一青霉素G标记PBPs，用胶体电泳分离PBPs等。
2各种青霉素结合蛋白研究进展
PBPs在不同菌种中各不相同，但对其分子结构，生理功能的研究发现每种菌种均有特异PBPs,PBPs的生理功能直接影响与其结合的抗生素的抗菌活性，这方面的研究已积累了大量的资料.但某些问题及研究结果的意义仍不十分清楚，为了研究者能迅速了解这方面研究进展，以下以大肠杆菌和肺炎球菌为例说明研究近况。
对大肠杆菌PBPs的研究最早开展，也是研究最多的，比较具有代表性。大肠杆菌含6种PBP，依次为PBPI,PBP2,PBP3.PBP4,PBPS,PBP6。
大肠杆菌PBP1主要功能为维持细胞形态,可分成PBP1a,PBPlbs两部分。PBPlbs主要分布于细胞内膜.亦有少部分分布于细胞外膜①。是细菌生长的重要蛋白，与抗生素结合可致细菌快速溶解.最近研究表明，PBP1b是一种球蛋白，具有2个密切相关的酶活性区，一为转肚酶活性区(转肚反应是细胞壁合成中的限速反应)，另一为转糖酶活性区②。PBPla具有PBPlbs替代酶的作用。缺乏PBPla的变异株能够存活，说明PBPla为细菌生长非必需蛋白.用仅有PBPla,PBPlbs基因或特异性分裂基因ftsA,ftsQ,pbpB,ftsZ变异的细菌株来研究PBPa与PBP1bs的功能时发现:PBPla不能独立维持细胞完整性，需与PBP2,PBP3及ftsQ基因产物一起才能维持细菌存活.而PBPIbs显然较PBPla有更强的生物合成功能，在缺乏PBP1a,PBP2,PBP3和ftsQ基因产物时变异株细菌仍能存活，在细菌分裂中，PBPlbs也起着相当作用，与肤聚糖的合成有关③④。
PBP2能维持大肠杆菌的张力，使菌体保持杆棒状。PBP2仅占PBPs的1%。美西林、克拉维酸和硫霉素与PBP2有高度亲和力。与PBP2结合后，可使细菌变成园球体，终致溶解、死亡。有实验表明在缺乏PBP2基因的菌株中，如能使PPGPP大量表达及分裂蛋白ftsZ,ftsA,ftsQ大量表达，细菌仍能存活并分裂繁殖⑤
PBP3与细菌分裂有关。在DNA复制完成后PBP3被激活，并催化梭基肤酶反应，产生细菌分裂必需的肚聚糖合成反应。低浓度的头抱菌素作用于PBP3使细菌成为丝状体(细菌分裂受阻，菌体却不断延长)，但一般菌体并不溶解⑥。
大肠杆菌PBP4同时具有D,D-梭肤酶活性及D.D一内肤酶活性⑦。缺乏PBP4的变异株能很好地存活，因此PBP4并不是β一内酞胺类抗生素的主要作用靶位。对PBP4一级结构的研究发现，编码PBP4主要活性部位的基因SXXK,SXN及KIG与A型件内酞胺酶是同源的⑧。在PBP4的SXXK与SXN之间有一区间，不同菌株PBP4氨基的顺序可在这区间删除不等量氨基酸，与原PBP4蛋白比较，分子量可从1%至79%不等，但对基本功能影响甚少⑨。
PBPS具梭基肤酶活性，缺乏PBPS的变异株对某些抗生素特别敏感，而且PBP5功能受PBP2影响。在缺乏PBP4与PEPS的变异株中，其功能可由PBP3完成。PBPS有膜型和游离型两种，其中游离型可在细胞内形成结晶⑩。在PBP5梭基端有一约100个氨基酸的末端，切除此末端仍保留PBP5蛋白与青霉素结合能力及酶活性，但容易被蛋白酶降解，说明这个拨基末端具有稳定蛋白质的作用⑾。
PBP6不具梭基肤酶活性，但在细菌静止期有稳定肤聚糖结构的作用。过量PBP6在胞浆内表达，可增加胞内胞膜小泡形成⑿。
肺炎球菌主要有6种PBP蛋白，分别为高分子的PBPla.PBP16,PBP2x,PBP2a,PBP2b及低分子的PBP3。在耐青霉素菌中，PBPs谱及PBP2b,PBP2x基因序列有较大差异。但敏感株PBPs谱却十分类似⒀。用血清学分离的菌株中，同一血清型PBPs谱亦有变异.很少有PBPs谱完全相同的菌株。
用基因分析的方法研究肺炎球菌中P$P1a,26,2x发现去除PBP2x,26基因，细菌不能存活，而缺乏PBPla的菌株可以获得，说明PBP2x,26是细菌生长必需蛋白质。PBPla对细菌生长及对苯哇西林敏感性影响均不大⒁。
PBP2x为肺炎球菌对头抱唾肪敏感株的主要作用靶位，而在耐药株中则成为数个靶位中的一个⒂PBP2x具催化不同酷类及硫醇酷底物水解与转肤反应.其催化活性与链霉菌R61的D.D-肤酶相似⒃。现已能应用基因工程合成PBP2x水溶性衍生物，且在时可得到结晶。该结晶能阻断头抱菌素衍生物的生色反应，说明此结晶具有酶活性⒄。肺炎球菌对青霉素耐药都由于出现高分子PBP2x基因，耐药菌与敏感菌比较，耐药株基因变异大。因基因变异起源于不同菌株间基因重组，就象PBP2b一样，耐药株PBP2x基因转移了使敏感株转变为耐药株⒅⒆.
PBP3为D,D-梭肤酶，对细菌胞膜性质影响很大。PBP3含量减少可使细菌对高温、甘氨酸及一些D-氮基酸特别敏感，且可使细菌对头抱唾肘产生耐药}⒇,PBP3的氨基酸序列与大肠杆菌PBPS,PBP6及枯草杆菌PEPS非常相似。PBP3以C端定位于胞膜.缺乏PBP3的细菌成不规则形态，体积增大，分裂严重受阻。在胞内多部位出现异常中隔，并产生厚薄不一的胞壁。
3不同PBP与卜内酞胺类结合能力及卜内酸胺类的联用
各种抗生素与PBP3亲和力均不同，因此抗菌活性亦不同。作用于不同PBP的压内酞胺类在联用时可产生协同作用。不同PBP与抗生素亲和力用玩表示(表1-3)。
美西林、克拉维酸可特异地与PBP2结合，多种青霉素、头饱菌素与PBPla亲和力较高。头饱拉定、头抱哇林与PBP1b亲和力高。头饱氨节、氨曲南、furazolocillin与PBP6亲和力较高.许多抗生素与PBPlbs及PBP3结合力往往有较大差异，因此联用时往往可产生协同效应。
美西林由于其特异地作用于PBP2，与较多作用于PBPI.PBP3的抗生素可产生协同作用，已证实其与氮节西林、阿莫西林、狡节西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、呱拉西林、头抱唾吩、头泡哇林、头抱氨节、头抱拉定‘、头饱孟多、头饱西丁均呈协同抗菌作用⑥。
克拉维酸亦是特异地与PBP2结合，其与件内酞胺类的协同作用是公认的，但由于克拉维酸是A-内酞胺酶的抑制剂，因此协同作用可由此特性而产生。但有人发现克拉维酸与卜内酞胺类合用在一些不产酶菌中亦有协同表现，这就与其特异性结合PBP2相关(表4)。
这方面研究资料并不太多，但如果我们能切实找到与PBP作用点相应的抗生素，那么这在联合用药上将是有效的。
4PBPs谱变异与耐药性产生
PBPs谱包括PBP种类及其百分含量.由于不同菌株的PBP谱有其特异性，现已成为细菌的一种分类方式。PBPs为抗生素的作用靶位，按此分类有助于对细菌耐药性的推测及估价。人们认识到PBPs谱的变异与细菌耐药性密切相关。
临床分离耐亚胺培南的不动杆菌，其PBPs与青霉素的结合能力下降，该菌株不产生卜内酥胺酶，其耐药性主要同PBPs蛋白变异所致，比较肠球菌的PBPs发现，25株中13株具附加77kDaPBP(PBP6'''')，而其它菌株均有52kDaPBP(PBP7)和46kDaPBP<PBPB),PBP6与青霉素敏感性关系不大，但PBP7与细菌耐药性却密切相关。对耐青霉素奈瑟球菌的研究亦发现PBP2结构改变，且其与抗生素的结合能力下降。PBP2基因谱中，耐药菌株与敏感菌株仅在一个175bp基因段差异较大。肺炎链球菌耐药株中PBPs基因转移至敏感株可使敏感株变为耐药株。
5耐药基因溯源
关于耐药基因来源问题分歧很多，有人认为可通过基因突变，还有人认为是通过不同菌株间的基因转移。现在又有人实验发现了一个有趣的现象。在诺卡菌产生头霉素基因中含3种基因片段:一为典型的编码卜内酞胺酶基因;一为编码PBP基因;另一为编码穿透胞膜蛋白基因，诺卡菌的各内酞胺酶与临床分离细菌中A型(β-内酞胺酶十分相似，此a-内酞胺酶对青霉素有活性，但对头霉素无作用，在诺卡菌中有8种PBPs，无一与头霉素结合，另一胞膜蛋白与抗生素合成及分泌的控制有关.其抗生素、卜内酞胺酶与PBPs产生均保持平衡，是其存活的条件在该实验中，可以看到在一个产生抗生素的微生物中，存在制衡现象.整个微生物界亦如生物圈一样存在生存的竞争及制衡现象，我们应用抗生素也正是利用了微生物界的这种制衡关系。但耐药基因是否亦是由此而来，即产抗生素的菌对敏感菌高度抑制使其表现为“失衡”而敏感菌从产抗生素的菌株得到耐药基因再次出现制衡，这是一个有趣而耐人寻味的问题.在控制耐药菌感染中，能否再次利用这种现象，以提供有效的治疗手段是值得探索的。
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