小鼠IL—2基因的RT—PCR克隆

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摘要：根据GenBank中小鼠的il-2 cDNA序列设计引物，从小鼠肝脏组织中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增出小鼠的IL-2基因。结果表明，克隆出了IL-2基因，获得了与预期大小相一致的850 bp的DN段，为研究其组成、结构和利用基因工程生产该药物打下基础。

关键词：小鼠；白细胞介素2（IL-2）基因；反转录

中图分类号：Q958 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3367-03

白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）是由CD4+ T细胞在受促有丝分裂素或异源物刺激后分泌的一种15 ku蛋白，具有广泛生物学活性的细胞因子。1983年，Taniguchi等[1]从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞中成功克隆IL-2 cDNA，并在大肠杆菌中得到高水平的表达。1986年，人IL-2克隆成功。随后，IL-2开始应用，主要作为免疫治疗剂和免疫增强剂。Weinberg等[2]报道将重组牛IL-2注入牛，可以明显降低细菌性炎的发病率；重组牛所生产的IL-2能促进牛病毒性腹泻死疫苗的免疫效果；IL-2分别与狂犬病疫苗或疟疾疫苗联合使用，对相应抗原的攻击有保护作用[3]。

本研究根据GenBank中小鼠的IL-2 cDNA序列，利用rt-pcr的高度灵敏性、特异性及操作简便快速等特点，克隆小鼠IL-2基因，为研究其组成、结构和利用基因工程生产该药物打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验小鼠由湖北医药学院附属太和医院生命科学研究所实验动物中心提供；反转录试剂盒及RT-PCR所需酶及耗材均购于Progema公司；试验所需其他试剂均为分析纯，购于上海强智生物科技有限公司。

2 结果与分析

2.1 小鼠肝脏组织的总RNA

采用Trizol法提取肝脏组织总RNA，结果看出：10个样品管中，都出现3条清晰的rRNA条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA，其中含量最多的为35S rRNA，其次为28S rRNA，最少的为5S rRNA（图1）。

在进行反转录时，挑选带型好、杂质少、rRNA含量较高的反应样品作进一步反转录反应的模板。第4管提取的RNA的量虽然多，但由于污染了基因组DNA或其他试剂，因此并不适合做反转录的转录模板，第2管和第6管也有一定的污染，且提取的RNA量不多，所以也不适合做反转录的模板。第1、3、7、8、9、10管提取的量虽然少，但没有受到污染。第5管提取的RNA质量较高，提取的量多、没有污染、没有降解，所以是反转录的最好的模板，下面进行反转录时的模板就是取自第5管的。

2.2 小鼠肝脏组织IL-2基因mRNA进行RT-PCR的结果

从反转录的产物进行PCR的结果可以看出，4个样品管都扩增出了一条约850 bp大小的条带，其大小与理论推测的一致（图2）。

3 讨论

1）本研究中，通过RT-PCR克隆到与预期的大小片段一致的DN段，说明通过简单的RT-PCR技术就能获得所需基因的cDNA序列。IL-2基因的克隆只是工作的开始，下一步工作是将获得的DNA进行TA克隆后测序，验证其序列的准确性，然后通过基因工程技术导入植物种子，以植物种子作为生物反应器表达IL-2干扰素，为干扰素的规模生产作准备。

2）RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，基本过程为：抽提总RNA，反转录获得cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。该方法具有良好的扩增反应及特异性、灵敏度，因此在癌症的早期诊断[4-6]、医学中病毒的快速检测[7-9]、细胞中基因表达水平的检测和细胞定基因的cDNA序列的克隆[10，11]等方面有极广泛用途。此项技术有几个优点：一是作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物，二是可以检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA，三是RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术更灵敏，更易于操作。随着人类基因组计划的完成，大量有价值的基因被发现，其序列被全世界研究者共享，因此相关的序列设计引物，通过RT-PCR直接扩增所需基因的cDNA序列，可以节约合成DNA的成本。

3）RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RNA分离最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。此外，在提取RNA时还应保证RNA的纯度和完整性。

参考文献：

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[2] WEINBERG A D， SWAIN S L. IL-2 receptor （Tac antigen） protein expression is down-regulated by the 5′-untranslated region of the mRNA[J]. J Immunol，1990， 144（12）：4712-4720.

[3] 李宏梅，郭慧君，李祥瑞，等.重组鸡IL-2作为传染性法氏囊病疫苗免疫增强剂对鸡细胞免疫水平的影响[J]. 中国兽医杂志，2005，41（6）：13-14.

[4] 彭玉林，郑文宏，黄强玲.实时荧光定量RT-PCR检测结直肠癌外周血hTERT mRNA的表达及临床意义[J].中国实验诊断学，2010，14（8）：1272-1273.

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[6] 刘 敏，孙 慧，刘贤锡.聚合酶链反应在前列腺癌诊断中的应用[J].生物医学工程研究，2004，23（2）：125-127.

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[8] 袁长青，李君文.一步单管反转录PCR快速检测水中甲型肝炎病毒[J].中国卫生检验杂志，1999，9（4）：243-245.

[9] 蔡雪珍，董 婷，魏惠永，等.应用反转录PCR检测临诊可疑丙型肝炎感染的结果分析[J].实用医学杂志，1994，10（2）：146-147.

[10] 祝 骥，马文丽，毛向明，等.人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J].第一军医大学学报，2005，25（4）：395-398.

[11] 吴汉平，吴开春.人环氧合酶-2（hCOX-2）编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究[J].世界华人消化杂志，2000，8（11）：1211-1217.