超声波提取防风色原酮研究论文

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【摘要】目的优选防风色原酮的超声波提取工艺。方法以升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量为指标,采用正交实验法优选超声波提取防风色原酮的最佳工艺。结果最佳提取条件为料液比为1∶30,超声时间45min,超声温度50℃,超声频率90kHz。结论采用超声波提取技术提取防风色原酮，提取时间短，提取效率高，可用于防风色原酮的提取。

【关键词】超声波;防风;色原酮;正交实验;高效液相色谱

Abstract：ObjectiveTooptimizetheextractionconditionsofchromonefromSaposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.byultrasonicwave.MethodsThecontentsofprimOglucosylcimifugin,cimifugin,5OmethylvisammiosideandsecOglucosylhamaudolwereservedasindicatingindexes,andtheextractionconditionswereoptimizedbyorthogonaltest.ResultsTheoptimalultrasonicconditionwasasfollows:thefeed-liquidratewas1∶30;theextractivetimewas45min;theextractivetemperaturewas50℃andthesupersonicfrequencywas90kHz.ConclusionTheextractionofchromonefromS.divaricatawithultrasonicwaveisfoundtobearapidandefficientextractionmethodwithshorttimeandhighproductionyield.

Keywords：Ultrasonicwave;Saposhnikoviadivaricata;Chromone;Orthogonaltest;HPLC

防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.为伞形科防风属多年生草本植物,以未抽薹的干燥根入药，是我国常用大宗中药材之一，具有解表祛风、胜湿、止痉功能，用于感冒头疼、风湿痹痛、风疹瘙痒、破伤风等［1］治疗。现代药理研究工业化其主要的活性成分为升麻素苷、升麻素、5O甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷等色原酮类以及多糖、挥发油等,具有解热、镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血小板聚集等多种功效［2～4］。超声波法提取中药有效成分是近年来发展起来的一种新方法,具有设备简单、操作方便提取时间短、效率高和节能等优点［5］。有关超声波提取防风中色原酮的研究已有报道［6］,但仅仅以升麻素苷和5O甲基维斯阿米醇苷两种色原酮为指标,而现在评价防风药材则以升麻素苷、升麻素、5O甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷4种色原酮为主要药效物质和质量控制评价指标［7］。本文以升麻素苷、升麻素、5O甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷4种色原酮的质量分数为指标,对超声波提取防风中4种色原酮的工艺参数进行了研究,为防风综合开发利用提供有效的提取方法和科学依据。

1仪器与材料

DL-1000E超声波清洗器(上海之信仪器有限公司);Agilent1100高效液相色谱仪(在线脱气机、四元泵、DAD检测器、手动进样器和Agilent化学工作站);AUY220电子天平(日本岛津)。提取用甲醇为分析纯(北京化工厂)和HPLC用甲醇为色谱纯甲醇(Fisher公司)。

实验材料系200709末采于白城GAP基地3年生未抽薹防风的根,经吉林农业大学张连学教授鉴定为伞形科柴胡属防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.。对照品由中国药品生物制品检定所提供,升麻素苷、升麻素、5O甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷批号分别为111522，111710，111523，111714。

2方法与结果

2.1防风4种色原酮的HPLC测定

2.1.1色谱分析条件DiamonsilC18(4.6mm×200mm,5μm)色谱柱;柱温30℃;波长254nm;甲醇-水梯度洗脱：甲醇：0～15min:20%～45%，15～25min:45%～70%;流速1ml·min-1。

2.1.2供试品溶液的制备防风根经45℃烘干,粉碎过30目筛。精密称取0.3g样品,浸泡2h,按照不同因素-水平进行超声提取,过滤,定容于100ml容量瓶中,过0.45μm滤膜,精密吸取20μl进样,按外标法测定。

2.1.3混合对照品溶液的配制精密称取经五氧化二磷干燥后的升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷适量,配成浓度为:升麻素苷:0.3mg·ml-1，升麻素:0.04mg·ml-1，5-O-甲基维斯阿米醇苷:0.5mg·ml-1和亥茅酚苷0.02mg·ml-1的混合对照品溶液。分别精密量取0.25，1，2，3，4，5ml,定容于10ml容量瓶中。

2.1.4标准曲线的制备分别吸取上述对照品溶液20μl按色谱条件进样,测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标(Y),进样量为横坐标(X),绘制标准曲线,计算回归方程。

升麻素苷:Y=3288.85374X+68.774277(r=0.99985),线性范围:0.15～3μg;

升麻素:Y=2578.41545X+7.520469(r=0.99972),线性范围0.02～0.4μg;

5-O-甲基维斯阿米醇苷:Y=2010X+68.751405(r=0.99959),线性范围0.25～5μg;

亥茅酚苷:Y=4125.81267X+5.313809(r=0.99971),线性范围0.01～0.2μg。

混合对照品和供试品的色谱图见图1。

图1混合对照品(a)和供试品(b)的HPLC图（略）

2.1.5稳定性实验精密吸取混合对照品溶液20μl,按色谱条件每隔4h进样1次,共测定7次。计算4种色原酮峰面积。结果升麻素苷、升麻素、5O甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的RSD值分别为0.98%，1.63%，1.53%和0.99%。表明24h内4个对照品稳定性良好。

2.1.6精密度实验精密吸取混合对照品溶液20μl,按上述色谱条件进行分析,连续5次。计算4种色原酮峰面积积分的RSD值分别为0.91%，1.54%，1.76%和1.95%。

2.1.7重复性实验精密称取防风样品5份，按上述操作方法制备供试品溶液,分别精密吸取供试品溶液20μl,按照上述色谱条件测定峰面积,结果4种色原酮峰面积积分的RSD分别为1.74%，2.68%，2.30%和2.16%。

2.1.8回收率实验取已知含量的供试品5份,分别加入定量的升麻素苷、升麻素、5O甲基维斯阿米醇苷及亥茅酚苷对照品,按上述色谱条件测定。计算4种色原酮的回收率,结果升麻素苷平均回收率为104.72%,RSD为1.57%(n=5);升麻素平均回收率为104.98%,RSD为1.64%(n=5);5-O-甲基维斯阿米醇苷平均回收率为104.93%,RSD为1.41%(n=5);亥茅酚苷平均回收率为104.47%,RSD为1.53%(n=5)。

2.2单因素分析

2.2.1料液比对总色原酮提取率的影响精密称定0.3g防风样品,分别准确加入甲醇3ml(料液比1∶10)、6ml(料液比1∶20)、9ml(料液比1∶30)、12ml(料液比1∶40)和15ml(料液比1∶50)在相同的条件下考察料液比对提取率的影响,结果总色原酮质量分数依次为0.9321%，0.9538%，0.9623%，0.9656%，0.9666%。可见在一定范围内,随着料液质量体积比的增加，提取率增幅增大，在料液比为1∶30处达到最大。当料液比继续增加时，总色原酮提取量的增加幅度较小。鉴于节约溶剂的原则,故将料液比定为1∶30左右。

2.2.2超声时间对提取率的影响在料液比1∶30,其它条件相同下选择时间15，30，45，60，75min进行超声萃取,结果总色原酮质量分数依次为0.9325%，0.9669%，0.9863%，0.989%，0.9906%。可以看出，随着超声波提取时间的加长，总色原酮提取率的增幅不断减少，这可能由于提取率正在接近最高值，并且由于在提取过程中杂质的不断增加，影响了色原酮提取量的继续升高。因此选择45min左右进行正交实验。

2.2.3超声频率提取率的影响在料液比1∶30,其它条件相同下选择超声频率30，50，70，90kHz进行超声萃取,结果总色原酮质量分数分别为0.9051%，0.9744%，1.008%，1.0144%。随着超声频率的增加,总色原酮的提取率不断增加,考虑超声波仪器本身的频率限制,故将频率定为70kHz左右。

2.2.4提取温度温度过高杂质溶出增加;温度过低,影响色原酮在甲醇的溶出。因此，综合考虑,选择30，40，50℃进行正交实验。

2.3正交实验设计及个因素水平设置根据单因素实验结果,选取料液比(A)、超声时间(B)、超声温度(C)和超声频率(D)为主要考察因素,各因素及水平设置见表1。正交实验采用4因素3水平正交表即L9(34)正交表进行实验,结果见表2,并对4种色原酮总量进行极差分析及方差分析。结果见表3～4。

表1因素水平（略）

以总色原酮为考察指标,极差R值大小显示因素作用主次分别为C>D>B>A;即提取温度C的极差值最大,表明提取温度是影响超声波萃取的最重要因素。方差分析结果(表4)表明，C、D因素对防风中色原酮的提取影响达到极显著水平(P<0.01)。B因素对防风中色原酮的提取影响达到显著水平(P<0.05)。其最适宜的提取工艺组合为A2B2C3D3,即料液比为1∶30,超声时间45min,超声温度50℃,超声频率90kHz。

2.4验证实验根据以上所选最佳工艺A2B2C3D3的条件,对防风样品中色原酮类成分的含量进行测定,结果总色原酮质量分数为1.0894%,1.0927%,1.0938%,平均值为1.092%,大于正交设计中的含量,所得结果正确,并且具有良好的重复性和较高的准确率,所筛选的提取工艺条件基本稳定,可作为防风中色原酮化合物的测定方法。

表2提取工艺正交设计实验结果（略）

表3极差分析（略）

表4方差分析（略）

3讨论

实验曾使用不同浓度的乙醇进行提取,但水溶性杂质也一起萃取出来,干扰了4种色原酮的HPLC检测,而用甲醇提取时水溶性杂质少,故本实验选用甲醇作为提取溶剂。

实验结果表明，提取温度和超声频率对提取效果有极显著的影响。分析原因认为适度增加温度有利于提高溶剂的溶解度，但温度过高导致溶剂挥发严重，杂质溶出增加；而高频率的超声波可产生强烈震动和空化效应，从而加速植物材料中有效成分的溶出。

通过单因素和L9(34)正交实验，确定防风4种色原酮超声波提取最佳工艺为：料液比为1∶30，超声时间45min，超声温度50℃，超声频率90kHz，其结果经验证实验确认条件可行。该法具有实验设备简单，操作方便，提取时间短，提取效率高等优点。作为中药提取新工艺，具有良好的应用前景和实际的指导意义。

【参考文献】

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