建鲤血清抗氧化酶的变化

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本文作者：刘 扬 池 磊 冯 琳 姜 俊 周小秋 单位：四川农业大学动物营养研究所 鱼类营养与安全生产四川省高校重点实验室 动物抗病营养教育部重点实验室 成都三旺农牧股份有限公司

活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)是生物体内氧化过程中产生的氧自由基，包括超氧阴离子自由基(O－2•)、羟自由基(•OH)、单线态氧(1O2)、过氧化氢(H2O2)以及由此衍生的有机过氧化物自由基(RO－•和ROO－•)和氢过氧化物(ROOH)等［1］。ROS能损伤脂类、蛋白质和核酸等生物大分子，威胁细胞功能，危害机体健康。鱼类组织的脂肪酸组成中多不饱和脂肪酸比例较陆生动物高，随着体质量的增加，其体内多不饱和脂肪的含量亦增加［2－4］。多不饱和脂肪酸极易受到ROS的攻击，引起脂质过氧化［5］。因此，不同年龄和组织鱼体的抗氧化状态、ROS清除能力以及抗氧化酶活性等不同。已有研究发现:胚胎期大菱鲆(Scophthalmusmaximus)体内过氧化脂肪含量较孵化后3d的仔鱼高3．8倍［6］;胚胎期尖吻鲈(Latescalcarifer)体内脂肪过氧化产物也显著高于孵出后3～25d的仔鱼［7］。可见，鱼类从胚胎期到孵化出过程中，体内的抗氧化状态、ROS清除能力以及抗氧化酶活性发生了变化。但是，关于幼鱼阶段体内抗氧化酶活性和非酶抗氧化物质含量的变化未见相关报道。为此，本试验拟研究建鲤幼鱼生长阶段体内抗氧化酶活性和非酶抗氧化物质含量的变化，为进一步阐明鱼体生长期抗氧化能力的变化规律奠定基础。

1材料与方法

1．1试验动物与设计选择体质量为(18．0±0．2)g的健康建鲤(Cyprinuscarpiovar．Jian)750尾，随机分成5组，每组3个重复，每个重复50尾。各组试验鱼均饲喂相同的试验饲粮，取样时间分别为0、14、28、42和56d。称重后，分别取血液、肝胰脏、肠道和肌肉组织用于测定抗氧化指标。

1．2试验饲料试验饲料以鱼粉、豆粕和大米蛋白粉为主要蛋白质源配制，其组成及营养水平见表1。饲料蛋氨酸、赖氨酸、泛酸、烟酸、维生素B6、肌醇和核黄素均参照本实验室研究结果［8］添加，粗蛋白质、粗脂肪、有效磷、必需脂肪酸、微量元素及部分维生素营养标准参照NRC(1993)鲤营养需要标准添加，鲤营养需要标准未列出的营养指标，维生素B12和维生素K参照虹鳟(Oncorhynchusmykiss)，维生素D参照斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)，硒和碘参照大西洋鲑(Salmosalar)营养需要标准［9］添加。

1．3饲养管理试验在四川农业大学动物营养研究所鱼类营养试验场进行。试验前用10%氢氧化钠对沉降池和水族箱消毒。购回的鱼暂养于自动水循环过滤和增氧的室内水族箱(90cm×30cm×40cm)中，并用400mg/L氯化钠消毒，试验饲料驯养1个月后分组称重，开始正式试验。试验期间，经过滤的循环水以1．2L/min的速度流入水族箱，水温保持在24～26℃，pH在7．0左右，溶氧在5．0mg/L以上。试验期56d，每天投喂6次，从07:00点开始，每隔3h饲喂1次，至22:00点结束。正式试验后每隔15d和每次称重后水族箱用400mg/L氯化钠消毒。

1．4样品采集每次取样前停食12h，每个重复随机选取10尾鱼，称重后尾静脉采血，血样于4℃冰箱中过夜，3000×g离心10min，取血清置－20℃冻存备用。采血后测体长，随后迅速分离背部肌肉、肝胰脏、肠道、头肾和后肾等组织器官，立即置于液氮中冷冻，随后转至－70℃保存备用。测定时在组织器官样中分别质量体积比1∶10加入冰冷生理盐水，超声波破碎成10%的组织匀浆，4℃、3000×g离心10min，取上清用于指标测定。

1．5指标测定

1．5．1丙二醛(malonaldehyde，MDA)和蛋白质羰基(proteincarbonyl，PCA)含量的测定采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，具体操作参照Livingstone等［10］的方法。PCA含量参照Halliwell等［11］的方法测定。

1．5．2抗超氧阴离子自由基能力(anti-superoxideanionfreeradicalability，ASA)和抗羟自由基能力(anti-hydroxylfreeradicalability，AHA)的测定ASA和AHA测定参照Jiang等［12］的方法。ASA的测定是根据芬顿(Fenton)反应，H2O2的量于Fenton反应产生的•OH量成正比，用Gress试剂显色，形成红色物质的量与•OH的多少成正比关系。AHA的测定是模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生O－2•，加入电子传递物质及Gress试剂，使反应体系呈现紫红色，用分光光度计测其吸光度，以维生素C做标准，计算出被检物品的AHA。

1．5．3抗氧化酶活性和非酶抗氧化物质含量的测定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-Px)活性测定参照Zhang等［13］的方法，过氧化氢酶(catalase，CAT)活性测定参照Aebi［14］的方法，谷胱甘肽还原酶(glutathionreductase，GR)和谷胱甘肽硫转移酶(glutathioneS-transferase，GST)活性测定均参照Lushchak等［15］的方法，还原型谷胱甘肽(reducedglutathione，GSH)含量测定参照Beutler等［16］的方法。

1．6数据处理和分析数据采用方差分析检验处理之间的差异显著性，并结合Duncan氏法进行多重比较，P＜0．05为差异显著水平，并对差异显著的相关指标进行相关分析。

2结果

2．1不同体质量建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中MAD和PCA含量不同体质量建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中MAD和PCA含量的变化见表2。血清MDA含量，18．0g组显著高于40．1、58．6和74．7g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肝胰脏MDA含量，74．7g组显著低于18．0g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肠道MDA含量变化规律与血清相同。肌肉MDA含量，18．0g组显著高于其余各组(P＜0．05);31．4g组显著高于58．6g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。血清PCA含量，58．6和74．7g组显著低于其余各组(P＜0．05);74．7g组显著低于58．6g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肝胰脏PCA含量，40．1、58．6和74．7g组显著低于18．0g组(P＜0．05);74．7g组显著低于31．4g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肠道PCA含量，18．0g组显著高于58．6和74．7g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肌肉PCA含量，74．7g组显著低于18．0和31．4g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。

2．2不同体质量建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中ASA和AHA不同体质量建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中ASA和AHA的变化见表3。血清和肠道ASA，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);31．4g组显著低于58．6和74．7g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肝胰脏ASA，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);74．7g组显著高于40．1g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肌肉ASA，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);58．6g组显著高于31．4g组(P＜0．05);其余各1495组之间差异不显著(P＞0．05)。血清AHA，18．0和31．4g组显著低于其余各组(P＜0．05);31．4g组显著高于18．0g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肝胰脏和肌肉AHA，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肠道AHA，18．0g组显著低于40．1、58．6和74．7g组(P＜0．05);74．7g组显著高于31．4g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。

2．3不同体质量建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中SOD和CAT活性不同体质量建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中SOD和CAT活性的变化见表4。血清SOD活性，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);31．4g组显著低于58．6和74．7g组(P＜0．05);40．1g组显著低于74．7g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肝胰脏SOD活性，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);31．4g组显著低于58．6和74．7g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肠道SOD活性，18．0g组显著低于40．1、58．6和74．7g组(P＜0．05);31．4g组显著低于74．7g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肌肉SOD活性，58．6和74．7g组显著高于18．0和31．4g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。血清CAT活性，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);58．6和74．7g组显著高于31．4g组(P＜0．05);74．7g组显著高于40．1g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肝胰脏CAT活性，74．7g组显著高于18．0和31．4g组(P＜0．05);58．6g组显著高于18．0g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肠道CAT活性，58．6和74．7g组显著高于18．0和31．4g组(P＜0．05);40．1g组显著高于18．0g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肌肉CAT活性，58．6和74．7g组显著高于18．0和31．4g组(P＜0．05);40．1g组显著高于18．0g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。

2．4不同体质量建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中GSH-Px、GST和GR活性不同体质量建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中GSH-Px、GST和GR活性的变化见表5。血清GSH-Px活性，58．6和74．7g组显著高于其余各组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肝胰脏GSH-Px活性，18．0和31．4g组显著低于其余各组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肠道GSH-Px活性变化规律与肝胰脏相同。肌肉GSH-Px活性各组之间差异不显著(P＞0．05)。血清GST活性，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);58．6和74．7g组显著高于31．4和40．1g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肝胰脏GST活性变化规律与血清相同。肠道GST活性，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);31．4g组显著低于58．6和74．7g组(P＜0．05)，31．4与40．1g组以及58．6与74．7g组之间差异不显著(P＞0．05)。肌肉GST活性，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05)，其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。血清GR活性，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);31．4g组显著低于74．7g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肝胰脏GR活性，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);31．4g组显著低于40．1、58．6和74．7g组(P＜0．05);40．1g组显著低于74．7g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肠道和肌肉GR活性，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。

2．5不同体质量建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中GSH含量不同体质量建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中GSH含量的变化见表6。血清GSH含量，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);74．7g组显著高于其余各组(P＜0．05);58．6g显著高于31．4和40．1g组(P＜0．05);31．4与40．1g组之间差异不显著(P＞0．05)。肝胰脏GSH含量，18．0g组显著低于其余各组(P＜0．05);58．6和74．7g组显著高于31．4和40．1g组(P＜0．05);58．6与74．7g组之间以及31．4与40．1g组之间差异不显著(P＞0．05)。肠道GSH含量，18．0g组显著低于40．1、58．6和74．7g组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。肌肉GSH含量，58．6和74．7g组显著高于其余各组(P＜0．05);其余各组之间差异不显著(P＞0．05)。

3讨论

正常生理状态下，少量适宜活性氧是机体抵抗某些有害菌、传导细胞信号等许多正常生命活动所必需的［17］。线粒体电子传递链是大多数动物ATP的主要来源［18］。进入线粒体电子传递链中的氧约有0．1%以ROS形式释放出来，引起脂肪、蛋白质损伤［19］。生物体以抗氧化系统清除机体内过量ROS，维持氧化与抗氧化的动态平衡。Bai等［20］指出，这种动态平衡移向氧化方向，ROS会与细胞发生反应，导致生物体氧化损伤，造成生物有机体脂质过氧化、糖基和蛋白质巯基氧化以及核酸染色体断裂等氧化应激。生物膜中不饱和脂肪酸受ROS攻击后，脂质过氧化形成MAD。鱼体组织中多不饱和脂肪酸含量高，易受ROS攻击，引起脂质过氧化［5］，脂肪过氧化产物会进一步引起蛋白质损伤［21］。PCA是蛋白质分子被ROS氧化损伤的重要标记［22］。本试验结果表明:随体质量增加，建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中MDA和PCA含量均降低，当体质量分别达到60．3、52．6、48．6和50．6g时，血清、肝胰脏、肠道和肌肉中MDA含量降到最低或达平台值;当体质量分别达到68．1、58．2、68．1和68．1g时，血清、肝胰脏、肠道和肌肉中PCA含量降到最低或达到平台值。这说明，20～60g建鲤机体脂质过氧化程度高，60g后则降至衡态;20～50g建鲤肌肉、肝胰脏和肠道中脂质过氧化程度高，50g后降低至衡态;20～70g建鲤机体蛋白质氧化程度高，70g后则显著降低;20～60g建鲤肌肉、肝胰脏和肠道蛋白质氧化程度高，60g后则降至衡态;肌肉、肝胰脏和肠道变化规律基本一致。关于体内脂质过氧化和蛋白质氧化的变化规律在幼鱼上未见相关研究报道，仅有鱼类孵化胚胎期和水花阶段脂质过氧化产物变化规律的研究。例如，大菱鲆孵化胚胎期体内过氧化脂肪含量较孵化后3d的水花高3．8倍［6］;尖吻鲈胚胎期脂肪过氧化产物也显著高于孵化后3～25d鱼体内的脂肪过氧化产物［7］。这与本试验中建鲤幼鱼体组织脂质和蛋白质氧化产物的变化规律相一致。这可能与幼鱼随体质量增加，体内自由基清除能力增强有关。O－2和•OH是引起细胞脂质和蛋白质氧化的主要自由基。O－2•作为机体中第1个生成的氧自由基，其进一步与其他分子作用，产生其他种类的氧自由基［23］。•OH是化学性质最活泼一种ROS，其产生后立即与其附近的细胞成分发生反应，对机体危害极大［24］。本试验结果表明，建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉组织中ASA和AHA随体质量增加而增强，但分别在40．1和31．4g后ASA和AHA不再变化。这说明，随体质量增加，建鲤ASA和AHA逐步增强，分别在40．1和31．4g达到稳态。机体ASA和AHA的增强可能与鱼体抗氧化酶活性增强和非酶抗氧化物质含量增加有关。SOD是机体清除氧自由基的重要酶类，能直接捕获O－2•，并与之发生歧化反应生成氧化性较小的H2O2［25］。CAT作为SOD下游酶类，能够有效清除SOD催化O－2产生的H2O2分解为H2O与O2［26］。GSH-Px则利用GSH作为底物，还原H2O2和清除烷烃氢过氧化物［27］。GST能够催化异物的带电基团与GSH亲核基团结合，清除脂质过氧化物［28］。本试验结果表明，建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉组织中SOD、CAT、GSH-Px和GST活性均随体质量增加而提高，体质量分别达到58．6、40．1、40．1和40．1g后，血清、肝胰脏、肠道和肌肉中SOD活性不再变化;体质量分别达到40．1、40．1、58．6和40．1g后，血清、肝胰脏、肠道和肌肉中CAT活性不再变化;体质量分别达到58．6、40．1、40．1和40．1g后，血清、肝胰脏、肠道和肌肉中GSH-Px活性不再变化;体质量分别达到58．6、40．1、40．1和31．4g后，血清、肝胰脏、肠道和肌肉中GST活性不再变化。这说明，建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中SOD、CAT、GSH-Px和GST活性随体质量增加逐步增强，终达稳态。关于体内SOD、CAT、GSH-Px和GST活性随体质量增加的变化规律在幼鱼上未见相关研究报道，但在胚胎到仔鱼上的相关研究发现:虹鳟和马氏沼虾(Macrobrachiummalcolmsonii)从胚胎到孵化出膜后的几天内，体内SOD、CAT、GSH-Px和GST活性逐渐增强［29－30］。因此，幼鱼随着体质量增加，各组织器官的抗氧化酶活性逐渐提高，增强了鱼体的ASA和AHA，继而增强了其抗脂质和蛋白质过氧化的能力。GSH不仅作为GSH-Px的辅酶催化还原过氧化氢和过氧化脂质，消除自由基造成的损伤，还可直接清除自由基，终止连锁反应。因此，GSH是机体非常重要的低分子非酶抗氧化物质，在维持机体氧化还原状态平衡中起着非常重要的作用［31］。氧化型谷胱甘肽(GSSG)可在GR与NADPH协同作用中被还原为GSH，防止O－2•在需氧生物体内的累积和•OH引起的生物膜损伤及蛋白质等大分子的降解破坏，从而维持生物膜完整，提高机体抗氧化能力［28］。本试验结果表明，建鲤血清、肝胰脏、肠道和肌肉中GSH含量和GR活性均随着体质量增加而提高，体质量分别达到58．6、31．4和58．6g后，肝胰脏、肠道和肌肉中GSH含量不再变化;体质量分别达到40．1、58．6、31．4和31．4g后，血清、肝胰脏、肠道和肌肉中GR活性达稳态;但血清GSH含量随体质量增加一直升高。相关研究已发现:在鱼类从胚胎到孵化后数天内GSH含量和GR活性的变化随个体的不断发育而呈逐渐升高［32］，与本试验结果相一致。这说明，随着幼鱼体质量增加和机体发育，体内非酶抗氧化系统的功能逐渐完善，从而能提高体内的ASA和AHA。保护机体组织免受的脂质过氧化和蛋白质氧化损伤。

4结论

建鲤幼鱼期，随体质量增加，血清和组织中SOD、CAT、GSH-Px和GST等抗氧化酶活性逐渐增强，低分子抗氧化物质GSH含量逐渐提高，从而使得ASA和AHA逐渐增强，脂质过氧化和蛋白质氧化产物含量逐渐降低，并最终达到稳态。