姜黄素类似物对Aβ25―35诱导的AD细胞模型细胞凋亡的影响
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[摘要] 目的 研究姜黄素类似物H8对Aβ25-35（β-amyloid protein 25-35）诱导的PC12细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响。 方法 CCK-8法检测Aβ25-35及姜黄素类似物H8的细胞毒性，以Aβ25-35诱导PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）建立ad细胞模型，并使用不同浓度的H8进行干预，通过RT-qPCR法检测各组凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达。 结果 H8在实验浓度范围内几乎无细胞毒性，Aβ25-35具有明显的细胞毒性并呈浓度依赖性，经过H8干预后细胞存活率明显升高，其中以20 μmol/L的H8作用最明显（P
[关键词] 姜黄素类似物；细胞凋亡；Caspase-3；Bcl-2；Bax
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）10-0001-04
Effects of curcumin analogues on cell apoptosis induced by Aβ25-35 in AD cell model
LI Chao BI Pengxiang DONG Yan LEI Jiayu YUAN Xiaohuan GUO Yanqin
Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of curcumin analogue H8 on the expressionof apoptosis-related genes Caspase-3， Bcl-2 and Bax in PC12 cells induced by Aβ25-35（β-amyloid protein 25-35）. Methods The cytotoxicity of Aβ25-35 and curcumin analogue H8 were detected by CCK-8. The AD cell model was established using PC12 cells （rat adrenal pheochromocytoma cells） induced by Aβ25-35 and the cells were treated with different concentrations of H8. The expression of Caspase-3， Bcl-2 and Bax mRNA were detected by RT-qPCR. Results H8 had almost no cytotoxicity in the experimental concentration range， while Aβ25-35 had obvious cytotoxicity and concentration-dependent. The cell survival rate was significantly increased after H8 intervention， among them， 20 μmol/L H8 was most significantly（P
[Key words] Curcumin analogues；Cell apoptosis；Caspase-3；Bcl-2；Bax
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种进行性发展的神经系统退行性疾病，表现为认知功能不断恶化，日常生活能力进行性减退和丧失[1]。AD的发病机制十分复杂，研究表明，神经细胞凋亡在AD发生发展中具有重要作用[2]。姜黄素（curcumin）是一种低分子量酚类化合物，提取于姜黄、郁金等姜黄属植物的根茎中，药理作用广泛，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、神经保护等多方面的药理作用[3，4]。近年来研究发现姜黄素能够抑制Aβ诱导的神经细胞凋亡。然而，姜黄素在体内的生物活性低、代谢快、吸收少、生物利用率低，极大地限制了其应用[5]。本实验以姜黄素为母体去掉其β-二酮基团，设计了稳定的、分子量更小的戊-1，4二烯-3-酮类似物（H8）。本研究利用Aβ25-35诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）建立AD细胞模型，观察姜黄素及其类似物对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的影响并观察其中凋亡相关基因及蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的变化，阐明姜黄素类似物H8治疗AD的可能机制，为研究和治疗阿尔茨海默病提供实验依据。
1材料与方法
1.1 药品与试剂
DMEM培养基、青链霉素混合液、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；CCK-8试剂盒（上海同仁化工DOJINDO）；Trizol（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（美国_氏公司Roche）；PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）；SYBR Green荧光染料（美国罗氏公司Roche）；姜黄素类似物H8[本课题组合成其化学名称为：（2E，5E）-2，5-双亚苄基环戊酮，HPLC检测纯度为99.3%]；Amyloid β-Protein Fragment 25-35（美国Sigma，货号A4559）。
1.2 仪器
CO2恒温培养箱（美国Thermo Fisher）、倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；超净工作台（德国ESCO）；PCR仪（德国Eppendorf公司）；分光光度计（美国Beckman公司）；荧光定量PCR仪（美国 ABI stepone）。
1.3 细胞
PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）购自上海中国科学院细胞库。
1.4 Aβ25-35配制方法
将1 mg Aβ25-35溶于943 μL三蒸水，配成1000 μmol/L母液，置于37℃培养箱孵育7 d，使之老化，分装，于-20℃冻存。
2 实验方法及分组
2.1 PC12细胞的培养
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12），为贴壁生长细胞，使用DMEM高糖培养基培养[内含10%胎牛血清及青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）]，于5% CO2的37℃恒温培养箱中培养。第2天细胞贴壁后换液，当细胞汇合度达到70%～80%时传代，细胞传代贴壁后呈梭型，并有较长的突触，取对数期生长细胞用于实验。
2.2 CCK-8法检测Aβ25-35、H8的细胞毒性
PC12细胞按4000个/孔的密度接种于96孔板，用含10% FBS的DMEM完全培养基进行培养，培养24 h后加入不同浓度的药物。实验分组为对照组、H8组、Aβ25-35组。H8组的浓度为1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，Aβ25-35组的浓度为0、1、5、10、20、40、80 μmol/L，药物作用24 h后，观察细胞存活情况，在每孔中加入10 μL CCK-8试剂，避光，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育4 h，室温下避光振荡3 min后在酶标仪450 nm处测定OD值，计算Aβ25-35的IC50值。细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。
2.3 姜黄素类似物H8对Aβ25-35诱导的AD细胞模型细胞活性的影响
根据方法2.2结果最终选择40 μmol/L的 Aβ25-35为最适造模浓度。将处于对数期生长的PC12细胞按4000个/孔的密度接种于96孔板，每孔100 μL。第一孔为对照孔，第2～6孔分别加入含H8的培养基预处理2 h，使其终浓度分别为2.5、5、10、20、40 μmol/L，然后加入Aβ25-35使其终浓度为40 μmol/L，共处理24 h，每个实验孔同时设置4个副孔。药物作用24 h后，观察细胞存活情况，在每孔中加入10 μL CCK-8试剂，避光，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育4 h，室温下避光振荡3 min后在酶标仪450 nm处测定OD值。
2.4 RT-qPCR检测姜黄素及H8对Caspase-3、Bcl-2、Bax基因表达的影响
取对数期生长的PC12细胞按4×105/mL的密度接种于6孔板，实验分为五组：（1）空白对照组：正常培养基培养细胞；（2）Aβ组：40 μmol/L Aβ25-35处理24 h；（3）低浓度H8+Aβ组：40 μmol/LAβ25-35+5 μmol/L H8；（4）中浓度H8+Aβ组：40 μmol/LAβ25-35+10 μmol/L H8；（5）高浓度H8+Aβ组：40 μmol/LAβ25-35+20 μmol/L H8。各实验组首先使用H8预处理细胞2 h，然后加入40 μmol/L Aβ25-35共处理22 h，24 h后收集细胞提取RNA，采用RT-qPCR技术检测各组细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达，通过2-ΔΔCT计算各基因相对表达水平。
2.5 统计学分析
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，使用One-way ANOVA对结果进行分析，以P
3 结果
3.1 姜黄素类似物H8及Aβ25-35的细胞毒性
在进行细胞实验之前，首先对姜黄素类似物H8及Aβ25-35的细胞毒性进行考察，如表2所示：与对照组（DMSO）相比，不同浓度（1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）的H8作用于细胞24 h后，均没有引起明显的细胞毒性，说明H8在检测浓度范围内对细胞几乎无毒性。 表3示：Aβ25-35干预PC12细胞，药物浓度为5 μmol/L时，细胞存活率为（86.82±2.74）%，与对照组相比，差异有统计学意义（P
3.2 H8对Aβ25-35诱导的AD细胞模型的影响
加入不同浓度的H8干预后观察对Aβ25-35诱导PC12细胞活性的影响。如表4所示：与对照组相比，Aβ组细胞存活率明显下降（P
3.3 Aβ25-35与H8对PC12细胞形态的影响
按方法2.3 加入不同浓度的Aβ25-35培养24 h后，显微镜下观察细胞形态变化如封三图1A所示：对照组细胞多呈梭型形，立w感强，细胞饱满，折光度好，突触较长，大多数具有小的突起，细胞密集，细胞碎片少。而经过不同浓度的Aβ25-35作用下，细胞总数量相对变少，细胞胞体皱缩，突触变短消失，贴壁性差，有脱壁漂浮现象，细胞碎片较多。随着Aβ浓度越大，细胞的状态越差，细胞碎片也越碓蕉唷＞过不同浓度H8干预后细胞数量增加，细胞形态明显得到改善（封三图1B）。
3.4 姜黄素类似物H8对凋亡相关基因表达的影响
按方法2.4使用不同浓度的H8预保护2 h，除对照组外其他各组给予40 μmol/L Aβ25-35诱导细胞凋亡。RT-qPCR方法检测H8对凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响。从表5中可以看出，与对照组相比，Aβ组的Bax、Caspase-3基因mRNA表达均增加，差异具有统计学意义（P
4 讨论
阿尔茨海默病的病理特征为：细胞外异常淀粉蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积形成的老年斑和细胞内过度磷酸化的Tau蛋白和微管形成的神经纤维缠结[6，7]，此外，还有因细胞凋亡而导致广泛的神经元和突触的丢失[8]。Aβ是构成SP的核心成分，也是神经纤维缠结以及血管淀粉样变性的生化基础[9]。Aβ可以通过多种途径引起促细胞凋亡因素增加和抗凋亡的因素减少，最终引起神经元的变性、凋亡和坏死[10]。Horiuchi M等[11]研究发现，β淀粉蛋白过表达和过度沉积是神经元功能障碍的触发者，在大脑内注射Aβ能够使神经元受损[12]。因此，拮抗Aβ诱导的细胞凋亡可能是治疗AD的一种方法。
姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、神经保护等多种药理作用。但姜黄素在体内的活性偏低、水溶性差、口服后体内代谢过快和生物利用度低[5，13]，这主要是由于姜黄素结构中β二酮结构片段的不稳定性所造成的[14，15]。本实验室通过化学合成方法设计了姜黄素类似物H8[化学名称为：（2E，5E）-2，5-双亚苄基环戊酮，纯度为99.3%]，前期经过HPLC检测姜黄素类似物H8降解率低，并且稳定性较好。
本实验以Aβ25-35诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）建立AD细胞模型，观察发现不同浓度Aβ25-35作用于细胞后，细胞存活率逐渐下降，细胞形态明显改变：细胞胞体皱缩，突触变短消失，出现凋亡的表现，并呈剂量依赖性。经过H8干预后细胞存活率明显升高，细胞形态得到改善，其中以20 μmol/L的H8作用最明显（P
综上，由于姜黄素类似物H8能有效地抑制Aβ诱导的细胞损伤，发挥抗凋亡作用，因此，深入研究和开发姜黄素类似物对阿尔茨海默病的治疗和预防具有重要意义。
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（收稿日期：2017-02-26）